鍺水增強免疫力作用研究

田小雪 張娜 李懷平 朱曉宇 吳洪革

【摘要】目的：評價鍺水增強免疫力作用；方法：隨機選取120尾受精后2天（2 dpf）轉(zhuǎn)基因中性粒細胞與巨噬細胞綠色熒光斑馬魚于六孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚，靜脈竇注射給予紅色熒光微球建立斑馬魚促吞噬模型。模型斑馬魚水溶給予4倍濃縮鍺水和陽性對照藥百令膠囊15 μg/mL濃度，同時設(shè)置正常對照組，每孔容量為3 mL。鍺水處理結(jié)束后，每組隨機取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下采集圖片，用圖像處理軟件計算巨噬細胞熒光強度及巨噬細胞吞噬清除后熒光微球殘留個數(shù)；結(jié)果：根據(jù)巨噬細胞熒光強度的統(tǒng)計學(xué)意義評價鍺水對斑馬魚巨噬細胞生成的促進作用，根據(jù)熒光微球殘留個數(shù)的統(tǒng)計學(xué)意義評價鍺水對斑馬魚巨噬細胞吞噬的促進作用。

【關(guān)鍵詞】鍺水；斑馬魚；增強免疫力；吞噬細胞

[中圖分類號]R979.5 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]2096-5249（2021）09-0222-03

Study on the enhancement of immunity by germanium water

TIAN Xiao-xue1， ZHANG Na2， LI Huai-ping1， ZHU Xiao-yu2， WU Hong-ge2*（1. ARURA Tibetan Medicine（Shan Dong）health industry co. Ltd ， Jinan Shandong 250100， China； 2. Zibo zichuan district hospital， Zibo Shandong255100， China； 3. Hunter Biotechnology， Inc. ， Hangzhou Zhejiang 310000， China）

[Abstract] Objective： to evaluate the immunity-enhancing effect of germanium water. Methods： 120 transgenic neutrophils and macrophage green fluorescent zebrafish randomly selected 2 days after fertilization in a six-well plate， and 30 zebrafish were cultured in each well（experimental group）. Red florescent microspheres were injected into the venous sinuses to establish the model of promoting phagocytosis in zebrafish. Model zebra look of soluble give four times concentrated water and positive control medicine best make Bailing capsules 15μg/mL. The concentration， at the same time set up the normal control group， each hole capacity of 3 ml. After treatment by the germanium water， each group andomly take 10 tail zebrafish acquisition mages under the fluorescence microscope， macrophage fluorescence intensity was calculated by the image processing software and residue after removal of macrophage cell fluorescent microspheres nueber； Results： according to the statistical significance if the fluorescence intensity of macrophages， the promoting effect of the wrong water on the generation of macrophages was evaluated， and the promoting effect of the wrong water on the phagocytosis of zebrafish macrophages was evaluated based on the statistical significance of the number of fluorescent microspheres.

[Key words] Germanium water； Zebra fish； Boost immunity； Phagocyte

鍺 （Ge）是俄國化學(xué)家門捷列夫1881年預(yù)言存在，德國化學(xué)家Winkler 1886 年從硫銀鍺礦中發(fā)現(xiàn)的，1913年Cor-ner從植物中測出了鍺，1929年Duloit 從動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了鍺[1-2]。

鍺作為一種有益元素，其抗癌、保健的功效越來越受到人們的重視，有文獻報道中探討了富鍺溫泉治病、療養(yǎng)功效的影響[3]，也有報道，在日本青森縣童子山，人們發(fā)現(xiàn)那里的童子山涌泉中含較高鍺，當(dāng)?shù)鼐用耖L期飲用該泉水，少有癌癥發(fā)生[1]，天芳悅潭溫泉水中已經(jīng)證實其富有鍺，鍺水除具有抗癌的作用，是否具有其他作用呢？本次實驗通過利用斑馬魚驗證了由天芳悅潭提供的鍺水經(jīng)濃縮后具有增強免疫力的作用。

斑馬魚（Danio rerio）屬于輻鰭亞綱（Actinoptery-gii）鯉科（Cyprinidae）短擔(dān)尼魚屬（Danio），是生物醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)模型的最佳的模式生物之一[4-9]。斑馬魚是公認的生態(tài)毒理學(xué)模型。在上個世紀(jì) 70 年代，國外已經(jīng)開始應(yīng)用斑馬魚進行重金屬和有機物的急性毒性研究[10]。

1 實驗部分

1.1實驗動物 轉(zhuǎn)基因中性粒細胞與巨噬細胞綠色熒光斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行，共120尾，每實驗組為30尾，年齡為受精后2天（2 dpf）（用于鍺水促進巨噬細胞生成及吞噬作用評價）。以上斑馬魚均飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3）。飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認證的要求。

1.2實驗儀器 與裝置SMZ645型解剖顯微鏡：Nikon公司產(chǎn)品；CP214型精密電子天平：奧豪斯公司產(chǎn)品；IM-300型顯微注射儀：Narishige公司產(chǎn)品；PC-10型拉針儀：日本Narishige公司產(chǎn)品；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：中國BOXUN公司產(chǎn)品；AZ100型電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡：Nikon公司產(chǎn)品。

1.3實驗材料 與試劑4倍濃縮鍺水兩批，無色透明液體，由天芳悅潭提供含鍺溫泉水，經(jīng)金訶藏藥（山東）健康產(chǎn)業(yè)有限公司進行濃縮后提供，一批供試品用于MTC測定，一批用于功效評價。百令膠囊，硬膠囊，內(nèi)容為灰色至灰黃色粉末，批號為171105，廠家為杭州中美華東制藥有限公司，使用前用超純水配制成2 mg/mL的母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。甲基纖維素：Sigma試劑公司；6孔板：Nest公司產(chǎn)品；熒光微球：L3030，Sigma試劑公司。

1.4實驗方法

2 實驗結(jié)果

2.1巨噬細胞生成促進作用 模型對照組巨噬細胞熒光強度為3783000像素，與正常對照組（3744020像素）比較P> 0.05，說明熒光微球造模對斑馬魚巨噬細胞生成無影響。百令膠囊15 μg/mL濃度組巨噬細胞熒光強度為4215617像素，與模型對照組（3783000像素）比較P<0.05，巨噬細胞生成促進率為11%，說明百令膠囊15 μg/mL濃度組對斑馬魚巨噬細胞生成有明顯的促進作用。4倍濃縮鍺水組巨噬細胞熒光強度為4375467，巨噬細胞生成促進率為16 %，與模型對照組（3783000像素）比較P< 0.01，說明4倍濃縮鍺水組對斑馬魚巨噬細胞生成有明顯的促進作用。詳見表1、圖1。

2.2巨噬細胞吞噬功能促進作用 百令膠囊15 μg/mL濃度組熒光微球殘留個數(shù)為10個，與模型對照組（26個）比較P< 0.001，熒光微球清除作用為60%，說明百令膠囊15 μg/mL濃度組對斑馬魚巨噬細胞吞噬有明顯的促進作用。4倍濃縮鍺水組熒光微球殘留個數(shù)為15個，與模型對照組（26個）比較P< 0.001，熒光微球清除作用為42%，說明4倍濃縮鍺水組對斑馬魚巨噬細胞吞噬有明顯的促進作用。詳見表2、圖2。

2.3實驗結(jié)論 在本實驗濃度條件下，4倍濃縮鍺水對斑馬魚巨噬細胞生成有明顯的促進作用，對斑馬魚巨噬細胞吞噬有明顯的促進作用。

3 討論

斑馬魚（Zebrafish， Danio rerio）是一種脊椎動物，與人類基因同源性高達87%，其信號傳導(dǎo)通路與人類基本近似，生物結(jié)構(gòu)和生理功能與哺乳動物高度相似 [11-12] ，由于體外培養(yǎng)、繁殖周期快、飼養(yǎng)成本低、體積小、發(fā)育周期短、體外受精、透明以觀察、單次產(chǎn)卵數(shù)較高、給藥量小及可進行高通量藥物篩選試驗，在心血管、神經(jīng)及代謝等系統(tǒng)方面越來越受到研究者的歡迎[13]。因此本實驗選用受精后2天（2 dpf）轉(zhuǎn)基因中性粒細胞與巨噬細胞綠色熒光斑馬魚進行試驗。根據(jù)實驗結(jié)果可知，將天芳悅潭提供富含鍺的溫泉水濃縮4倍后對斑馬魚巨噬細胞生成和吞噬有明顯的促進作用，具有一定的增強免疫力的作用，但其作用機理等方面的內(nèi)容目前尚不清楚，后期需要繼續(xù)進行深入的研究。

參考文獻

[1] 劉禹若. 關(guān)于含鍺飲用天然礦泉水幾個問題的探討[J]. 上海地質(zhì)， 1994， 52（4）： 5-14.

[2] 李景巖. 有機鍺與人體健康[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2007， 34（13）： 2465-2467.

[3] 沈驍， 等. 青海貴德縣扎倉溫泉高鍺泉水開發(fā)利用探討[J]. 2016， 25（1）： 230-232.

[4] 常嘉， 陸亮， 常艷， 等. 斑馬魚胚胎發(fā)育毒性評價方法的建立[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志， 2013， 27（3）： 590-591.

[5] 宋志慧， 王慶偉. Cu2+、Cd2+和Cr6+對斑馬魚聯(lián)合毒性作用和生物預(yù)警的研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報， 2011， 6（4）： 361-366.

[6] 宋明霞， 陳天榮， 錢豪文， 等. 3種重金屬對斑馬魚的聯(lián)合毒性及迷迭香酸的保護作用研究[J]. 煙臺大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)與工程版）， 2020， 33（1）： 43-48.

[7] LAMMER E， CARR G J， WENDLER K， et al. Is thefish embryo toxicity test （FET） with the zebrafish （Danio rerio）a potential alternative for the fish acute toxicity test？ [J]. Com-parative Biochemistry&Physiology Part C Toxicology & Pharma-cology， 2009， 149（2）： 196-209.

[8] DAI Y J， JIA Y F， CHEN N， et al. Zebrafish as amodel system to study toxicology[J]. Environmental toxicology and chemistry， 2014， 33（1）： 11-17.

[9] ROCHA O P， DEOLIVEIRA D P. Investigation of a Brazilian tannery effluent by means of zebra fish （Danio rerio）embryo acute toxicity （FET） test[J]. J Toxicol Environ Health A， 2017， 80（19-21）： 1078-1085.

[10] 郭勝亞， 朱曉宇， 周佳麗， 等. 斑馬魚在功能性食品研究中的應(yīng)用進展[J]. 中國實驗動物學(xué)報， 2020， 28（1）： 143-147.

[11] Clark MD， Hennig S， Herwig R， et al. An oligonucleotide fingerprint normalized and expressed sequence tag characterized zebrafish cDNAlibrary [J]. Genome Res， 2001， 11（9）： 1594-1602.

[12] Postlethwait JH， Woods IG， Ngo-Hazelett P， et al. Zebrafish comparative genomics and the origins of vertebrate chromosomes [J]. GenomeRes， 2000， 10（12）： 1890-1902.

[13] 夏婧， 游秋云， 黃攀攀， 等. 中藥酸棗仁對斑馬魚睡眠剝奪模型的行為學(xué)及神經(jīng)遞質(zhì)受體的影響[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2019， 30 （9）： 2061-2064.

*通信作者：吳洪革，男，淄博市淄川區(qū)醫(yī)院，藥學(xué)專業(yè)。E_mail：wuhongge1978@126.com