植物蛋白酶研究開(kāi)發(fā)進(jìn)展

劉洋 朱依諄 段小群

【摘要】本綜述主要對(duì)各植物蛋白酶的來(lái)源、純化過(guò)程、結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行文獻(xiàn)研究，總結(jié)了植物蛋白酶在各行業(yè)的最新進(jìn)展和可能的應(yīng)用，并建議進(jìn)一步開(kāi)發(fā)植物來(lái)源的蛋白酶。

【關(guān)鍵詞】植物蛋白酶;純化;結(jié)構(gòu);應(yīng)用

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)的某些酶類的總稱，廣泛存在于動(dòng)物、植物以及各類微生物中。目前已應(yīng)用在皮革化工，生物醫(yī)藥、食品等方面，約全球工業(yè)酶的60%都與蛋白酶相關(guān)。

植物蛋白酶產(chǎn)品是以植物為原材料，按照用途的需求，經(jīng)過(guò)提取分離過(guò)程，定向獲取和濃集植物中的一種或多種有效成分，而不改變其有效成分結(jié)構(gòu)而形成的產(chǎn)品。開(kāi)發(fā)較成功的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶等。

1.植物蛋白酶的來(lái)源

木瓜蛋白酶（Papain）存在于番木瓜（Carieapapaya）的各個(gè)部位，在未成熟的乳汁中含量最豐富。早在1937年，木瓜蛋白酶中的半胱氨酸蛋白酶就已經(jīng)從番木瓜中分離并鑒定。菠蘿蛋白酶又稱菠蘿酶，由菠蘿（Ananascomoslgs和A.bracteatus）果實(shí)、莖及芯中提取制備，分別是莖菠蘿蛋白酶和果實(shí)菠蘿蛋白酶。無(wú)花果蛋白酶主要存在于無(wú)花果（Fig，F(xiàn)icuscaricaL）的乳膠及花托中。該果原產(chǎn)于西亞沙特阿拉伯、也門一帶，在我國(guó)主要分布在新疆南部的阿圖什、疏附等地。

2.植物蛋白酶的純化

木瓜蛋白酶的常用分離純化過(guò)程是采用硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換柱色譜、Ca++Pure-HA柱色譜，可獲得比活力較高的純酶。

菠蘿蛋白酶的純化目前有常規(guī)方法和現(xiàn)代方法，常規(guī)方法有采用離心、超濾、冷凍干燥等技術(shù)，但是常規(guī)方法操作過(guò)程繁瑣，經(jīng)常導(dǎo)致產(chǎn)酶率低?，F(xiàn)代方法主要有凝膠過(guò)濾、離子交換層析、親和層析等方法，但此方法的產(chǎn)品回收成本更高，還會(huì)存在穩(wěn)定性問(wèn)題。在羅夢(mèng)的實(shí)驗(yàn)中，采用（NH4）2SO4鹽析結(jié)合超濾法提取的菠蘿蛋白酶再經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換柱純化，結(jié)合常規(guī)方法與現(xiàn)代方法，獲得了純度更高的菠蘿蛋白酶。

無(wú)花果蛋白酶的純化主要有凝膠過(guò)濾、離子交換層析等方法。通過(guò)柱層析得到純度和比活力都較高的無(wú)花果蛋白酶。

3.植物蛋白酶的結(jié)構(gòu)

木瓜蛋白酶的分子量為23.4kDa，含有212個(gè)氨基酸殘基。酶的活性中心至少有Cys25、His159和Asp15三種氨基酸殘基存在]，另有三對(duì)二硫鍵由六個(gè)半胱氨酸殘基形成，但都不位于活性部位[7]，對(duì)木瓜蛋白酶的活性及性質(zhì)并無(wú)影響]。

菠蘿蛋白酶是一個(gè)23.8kDa的α+β蛋白，含有212個(gè)氨基酸殘基，屬于半胱氨酸蛋白酶家族。它由多種殘基組成，包括Cys、Trp、Phe和Tyr四種殘基，此外，它還含有3個(gè)二硫鍵和1個(gè)天冬酰胺低聚糖鏈。富含β片層的結(jié)構(gòu)也使其具有致密的剛性球狀構(gòu)象。

無(wú)花果蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶家族。研究發(fā)現(xiàn)，SharmaA等人從無(wú)花果膠乳中分離純化出一種絲氨酸蛋白酶，分子量為47kDa，該酶分子結(jié)構(gòu)由17個(gè)色氨酸、31個(gè)酪氨酸和9個(gè)半胱氨酸殘基組成。MohamedAzarkan等人的研究中共分離了五種無(wú)花果蛋白酶，質(zhì)譜分析表明，A、B、C、D蛋白分別對(duì)應(yīng)于4種新的半胱氨酸蛋白酶。蛋白D1和D2可能對(duì)應(yīng)于兩種異構(gòu)體，并用質(zhì)譜準(zhǔn)確的測(cè)定了五種無(wú)花果蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量[15]。

4.植物蛋白酶的應(yīng)用

4.1木瓜蛋白酶

在食品工業(yè)中，木瓜蛋白酶可作為肉類嫩化劑、面包膨松劑、啤酒澄清劑和其他用途等。作為啤酒澄清劑，木瓜蛋白酶可與啤酒中的多元酚形成穩(wěn)定狀態(tài)，防止啤酒冷藏時(shí)混濁。與此同時(shí)，木瓜蛋白酶作為肉類嫩化劑，可以水解肌肉中的蛋白質(zhì)，簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使人體食用后易被消化吸收。

在科研中木瓜蛋白酶還可用于分離細(xì)胞。BrittniAScruggs等人在研究治療視網(wǎng)膜退行性失明時(shí)，應(yīng)用木瓜蛋白酶分離視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，細(xì)胞存活率顯著提高。

4.2菠蘿蛋白酶

在食品工業(yè)，菠蘿蛋白酶不僅可用于干酪的生產(chǎn)，肉類的嫩化，還可用于脫水豆類、嬰兒食品生產(chǎn)和日常食品添加劑等。例如，菠蘿蛋白酶可以替代鹽酸作為牡蠣肉的水解劑。

在醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)，菠蘿蛋白酶也發(fā)揮著重要的作用。經(jīng)相關(guān)臨床研究表明，菠蘿蛋白酶能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng);抑制血小板聚集;還可治療炎癥和水腫，具有激活炎癥反應(yīng)的潛力。菠蘿蛋白酶應(yīng)用于燒傷脫痂，可加快新皮的移植，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明菠蘿蛋白酶對(duì)正常皮膚無(wú)影響。

在醫(yī)療美容行業(yè)，菠蘿蛋白酶還具有嫩膚、美白去斑的良好功效。研究發(fā)現(xiàn)，菠蘿蛋白酶作用于皮膚老化的角質(zhì)層，可以促使其退化分解，加快皮膚新陳代謝，使皮膚呈現(xiàn)良好白嫩狀態(tài)。

4.3無(wú)花果蛋白酶

無(wú)花果蛋白酶與木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶在食品、化工、醫(yī)藥行業(yè)的用途相似。另外，無(wú)花果蛋白酶可以通過(guò)蛋白水解產(chǎn)生活性抗體片段。例如，五種不同的小鼠單克隆抗體被無(wú)花果蛋白酶催化消化，目的是得到活性F（Ab）2片段，與彈性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胃蛋白酶比較，無(wú)花果蛋白酶水解效果最好，在所有情況下，對(duì)所有被檢測(cè)的抗體都有快速和可重復(fù)性的反應(yīng)，這五種單克隆抗體均被還原為活性F（Ab）2片段。

除此之外，無(wú)花果蛋白酶已被證明對(duì)多回螺旋線蟲、小鼠原旋蟲和鞭蟲（嚙齒線蟲）有效。

4.4其它植物蛋白酶

木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶是目前市場(chǎng)開(kāi)發(fā)較多，使用范圍較廣的植物蛋白酶，此外還有獼猴桃、生姜等植物中也存在蛋白酶，并有一些文獻(xiàn)報(bào)道及市場(chǎng)應(yīng)用，與上述蛋白酶同樣具有肉類嫩化、奶酪生產(chǎn)、啤酒澄清等作用。除上述作用外，RezaYarani等人用獼猴桃蛋白酶成功分離培養(yǎng)了黑素細(xì)胞.表明獼猴桃蛋白酶可作為不同組織細(xì)胞分離的膠原酶。另外，近年在羅漢果中發(fā)現(xiàn)蛋白酶，經(jīng)過(guò)前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，該酶對(duì)酪蛋白具有很強(qiáng)的降解作用，約是木瓜蛋白酶的15倍，是一種極具特色的植物蛋白酶。而且羅漢果是廣西桂林地區(qū)的藥食兩用的道地藥材，產(chǎn)量豐富，這一自然條件為羅漢果蛋白酶的開(kāi)發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。

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