含氮雜環(huán)酸柏木酯合成與抑菌活性研究

孟斌斌，朱凱

(1.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037； 2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

杉木精油的主要成分為柏木醇、α-柏木烯、β-柏木烯等，通過(guò)結(jié)晶和重結(jié)晶,可得柏木醇等產(chǎn)品[1-4]。柏木醇為叔醇，空間位阻較大，雖可合成乙酸柏木酯、肉桂酸柏木酯和丙烯酸柏木酯等，但原料的位阻對(duì)叔醇酯化效率有明顯的影響[5-9]。

含氮雜環(huán)化合物在生物的新陳代謝和生理活動(dòng)過(guò)程中有著非常重要的調(diào)節(jié)作用[10]。喹啉、吡啶、吲哚、嘧啶等含氮雜環(huán)衍生物具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、殺蟲和消炎等多種生物活性，經(jīng)常被設(shè)計(jì)建構(gòu)在某些分子的結(jié)構(gòu)上，賦予這些分子新的生物活性[11-14]。本文采用DCC/DMAP法催化酯化合成含氮雜環(huán)酸柏木酯，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

柏木醇(98%)，自制；瓊脂粉、蛋白胨、酵母提取物、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、氘代二甲亞砜、喹哪啶酸、吲哚-3-羧酸、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、碳酸鈉、石油醚、鹽酸、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、溴化鉀、氫氧化鈉均為分析純；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由南京野生植物研究所提供；大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)由本校實(shí)驗(yàn)室提供。

YM系列不銹鋼智能型立式壓力蒸汽滅菌鍋；ZHWY-2102C型雙層小容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器；SHP-250型生化培養(yǎng)箱；AVANCE III 600 MHz型超導(dǎo)核磁共振譜儀；VERTEX 80V型全數(shù)字紅外光譜儀。

1.2 含氮雜環(huán)酸柏木酯合成

以柏木醇和含氮雜環(huán)酸為原料，通過(guò)DCC/DMAP催化酯化合成了含氮雜環(huán)酸柏木酯，合成路線如下：

1.2.1 喹哪啶酸柏木酯的合成與結(jié)構(gòu)表征 取1 mmol 喹哪啶酸(0.176 7 g)與1.1 mmol DCC(0.229 3 g)加入10 mL二氯甲烷中，冰浴下攪拌0.5 h。加入1 mmol柏木醇(0.226 9 g)與0.1 mmol DMAP(0.012 3 g)的混合物，室溫?cái)嚢?4 h，反應(yīng)結(jié)束。過(guò)濾，旋蒸得到固體產(chǎn)物，加入10 mL乙酸乙酯，4 ℃下放置12 h，過(guò)濾，以5%HCl溶液、10%Na2CO3洗滌，直至呈中性為止，再用飽和NaCl清洗，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓蒸餾得到固體產(chǎn)物。粗品經(jīng)柱層析純化(石油醚與乙酸乙酯體積比為4∶1)，得到白色粉末狀物質(zhì)0.078 0 g，產(chǎn)率為21%。

1.2.2 吲哚-3-羧酸柏木酯的合成與結(jié)構(gòu)表征 取1 mmol吲哚-3-羧酸(0.164 4 g)與1.1 mmol DCC(0.229 3 g)加入10 mL丙酮中，冰浴下攪拌0.5 h。加入1 mmol柏木醇(0.226 9 g)與0.1 mmol DMAP(0.012 3 g)的混合物，55 ℃下攪拌6 h。過(guò)濾，旋蒸得到固體產(chǎn)物，加入10 mL乙酸乙酯，4 ℃下放置12 h。 過(guò)濾，以5%HCl溶液、10%Na2CO3洗滌，直至呈中性為止，再用飽和NaCl清洗，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓蒸餾得到固體產(chǎn)物。粗品經(jīng)柱層析純化(石油醚與乙酸乙酯體積比為4∶1)，得到白色粉末狀物質(zhì)0.082 5 g，產(chǎn)率為23%。

1.3 抑菌活性研究

采用濾紙片法測(cè)定樣品的抑菌圈，確定樣品的抑菌活性。

1.3.1 液體LB培養(yǎng)基的配制 在950 mL的去離子水中加入酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，以5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，用去離子水定容至1 L，在103.4 kPa(15 psi)高壓下蒸汽滅菌20 min。

1.3.2 固體LB培養(yǎng)基的配制 在950 mL的去離子水中加入酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，加熱融化，以5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，用去離子水定容至1 L，在15 psi高壓下蒸汽滅菌20 min。

1.3.3 菌種的活化 取0.1 mL菌液加入10 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)8～10 h，待用。

東柳院村全年日照為2710小時(shí)，幅射能量132856千卡，得天獨(dú)厚的自然能源為推進(jìn)光伏扶貧創(chuàng)造了先決條件。武志鋒抓住機(jī)遇，獲得了光伏扶貧示范項(xiàng)目，總投資75萬(wàn)元，總發(fā)電100KW，2017年3月建成發(fā)電，14個(gè)月已發(fā)電18萬(wàn)度，創(chuàng)產(chǎn)值15.84萬(wàn)元。他給深度貧困戶毎年每戶發(fā)放3000元；給重度殘疾人和80歲以上的老人毎年每戶補(bǔ)貼1000元；給本村考入本科大學(xué)的學(xué)生當(dāng)年獎(jiǎng)勵(lì)2000元、專科1000元。

1.3.4 濾紙片制備 選用吸水性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)濾紙，6 mm打孔機(jī)打下圓紙片，紫外燈下滅菌備用。

1.3.5 抑菌活性測(cè)定 無(wú)菌條件下，在直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，加入20 mL冷卻到50 ℃的固體培養(yǎng)基(已加入1 mL活化后的菌液)，冷卻至室溫，將滅菌后的濾紙片沾取不同濃度的精油貼在營(yíng)養(yǎng)平板上，濾紙間距離適中。同時(shí)，用丙酮作為對(duì)照。用封口膜將培養(yǎng)皿密封后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，測(cè)定其抑菌圈直徑。每組3次平行加空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性

柏木醇及含氮雜環(huán)酸柏木酯對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑見(jiàn)表1。

表1 不同樣品對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone diameter of different samples against Bacillus subtilis

由表1可知，3種樣品對(duì)枯草芽孢桿菌均有一定的抑制效果。其中喹哪啶酸和柏木醇濃度為2.5 mg/mL時(shí)就可達(dá)到對(duì)枯草芽孢桿菌的中度敏感。在濃度為5.0 mg/mL時(shí)，柏木醇、吲哚-3-羧酸柏木酯和喹哪啶酸柏木酯的抑菌圈分別為12，11，13 mm，3種樣品對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果順序?yàn)猷泥に岚啬觉?柏木醇>吲哚-3-羧酸柏木酯。

2.2 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性

柏木醇及含氮雜環(huán)酸柏木酯對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑見(jiàn)表2。

表2 不同樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone diameter of different samples against Staphylococcus aureus

由表2可知，3種樣品對(duì)金黃色葡萄球菌均具有一定的抑菌效果，喹哪啶酸柏木酯的抑菌效果最好，濃度為5.0 mg/mL的條件下抑菌圈可達(dá)13 mm。 吲哚-3-羧酸柏木酯對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果較差，在1.3 mg/mL的濃度下無(wú)抑菌效果。

2.3 對(duì)大腸桿菌的抑菌活性

柏木醇及含氮雜環(huán)酸柏木酯對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑見(jiàn)表3。

表3 不同樣品對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑Table 3 Inhibition zone diameter of different samples against Escherichia coli

由表3可知，不同樣品對(duì)大腸桿菌均有一定的抑菌效果。柏木醇對(duì)大腸桿菌的抑制效果較差，在5.0 mg/mL的濃度下抑菌圈直徑為9 mm，為低度敏感。含氮雜環(huán)酸柏木酯對(duì)大腸桿菌在5.0 mg/mL的濃度下抑菌圈直徑在10 mm以上，為中度敏感。經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾的吲哚-3-羧酸柏木酯和喹哪啶酸柏木酯對(duì)大腸桿菌均有良好的抑制效果。3種樣品對(duì)大腸桿菌的抑制效果順序?yàn)猷泥に岚啬觉?吲哚-3-羧酸柏木酯>柏木醇。

3 結(jié)論

通過(guò)DCC/DMAP催化酯化合成了兩種含氮雜環(huán)酸柏木酯，濾紙片法抑菌活性研究表明，柏木醇及含氮雜環(huán)酸柏木酯均具有良好的抑菌活性，柏木醇對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌在5.0 mg/mL的濃度下即可達(dá)到中度敏感。含氮雜環(huán)酸柏木酯對(duì)大腸桿菌有著良好的抑制作用，在5.0 mg/mL的濃度下抑菌圈直徑均在10 mm以上，為中度敏感，而柏木醇在同等濃度下只為低度敏感。經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾的含氮雜環(huán)柏木酯具有良好的生物活性，具備進(jìn)一步研究作為廣譜抗菌劑的價(jià)值。