MicroRNA-140抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲*

傅衛(wèi)紅，倪慶鋒

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院1胸外科；2胃腸外科，江蘇 226001）

胃癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,主要致病因素包括飲食因素、環(huán)境因素、慢性幽門螺旋桿菌感染以及遺傳易感性等[1]。2018年全球有784 000人死于胃癌,高發(fā)病區(qū)集中在東亞、東歐以及南美洲[2]。我國(guó)是胃癌高發(fā)地區(qū),隨著人民生活和衛(wèi)生水平的提高,胃癌發(fā)生率和死亡率逐年降低,但仍是排名第二的癌癥死亡原因[3-4]。近年來(lái)隨著外科技術(shù)、放化療、新輔助治療、分子靶向治療以及早期診斷方法的應(yīng)用,全球胃癌患者5年生存率有所提高,但在東亞國(guó)家尤其是在中國(guó)胃癌5年生存率依然很低[5-6]。因此,篩選有效的胃癌診斷指標(biāo)及治療靶標(biāo),對(duì)改善患者的預(yù)后具有重要意義。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的單鏈、非編碼RNA,通過(guò)序列特異性方式抑制mRNA翻譯蛋白或誘導(dǎo)mRNA降解,參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移等多種生物學(xué)行為,miRNAs作為抑癌基因或致癌基因參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展[7-8]。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和宮頸癌中,miR-140通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑癌作用[9-10]。本實(shí)驗(yàn)收集我院2020年1月—12月行胃癌根治手術(shù)切除的胃癌及其癌旁組織標(biāo)本40例,采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)胃癌、癌旁組織及胃癌細(xì)胞系中miR-140含量,并通過(guò)在胃癌細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)及干擾miR-140,分析miR-140對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用,為胃癌治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 胃癌根治手術(shù)切除的胃癌及癌旁組織標(biāo)本40例,其中男性24例,女性16例,年齡35～63歲,平均48.3±3.7歲。所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn),在手術(shù)后立即儲(chǔ)存在液氮中備用。本研究經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 胃癌細(xì)胞系 人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN45、MKN28、SGC7901、BGC823及正常人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1(美國(guó)ATCC公司),在含10%胎牛血清、鏈霉素(50μg/mL)和青霉素(50 U/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基中于5% CO2,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-140：采用TRIzol(Invitrogen公司)提取組織及胃癌細(xì)胞系RNA,參照試劑盒說(shuō)明書操作,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。miR-140表達(dá)水平采用TaqMan MicroRNA試劑盒檢測(cè),反應(yīng)條件：預(yù)變性,95℃,5 min,1個(gè)循環(huán);循環(huán)反應(yīng)：95℃,10 s,60℃,30 s,40個(gè)循環(huán)。U6為內(nèi)參,以2-ΔCt和2-ΔΔCt進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 miR-140模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染：采用Lipofectamine 3000試劑(Invitmgen公司)轉(zhuǎn)染miR-140模擬物及其對(duì)照(模擬物NC),miR-140抑制劑及其對(duì)照(抑制劑NC),參照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將100μL培養(yǎng)基內(nèi)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到96孔板,每孔約1 000個(gè)細(xì)胞,37℃下培養(yǎng),使用CCK-8試劑盒(Dojindo Laboratories),在0 h,24 h,48 h,72 h和96 h測(cè)量450 nm處吸光度,繪制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞接種在6孔板,500個(gè)細(xì)胞/孔,培養(yǎng)2～3周。PBS洗滌2次,多聚甲醛固定30 min,然后用結(jié)晶紫染色,計(jì)數(shù)大于2 mm的克隆。

1.3.5 細(xì)胞小室遷移及侵襲能力檢測(cè)：采用Invasion：Transwell小室(BD Biosciences),纖維素膜孔徑為8 mm。侵襲實(shí)驗(yàn)：先在小室底部鋪上Matrigel膠,下室中加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基750μL,上室中加入無(wú)胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基500μL及1×105個(gè)細(xì)胞懸液,在5%CO2,37℃下培養(yǎng)48 h。小室下表面細(xì)胞用多聚甲醛固定,Giemsa染色,顯微鏡下觀察并拍照,計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。遷移實(shí)驗(yàn)小室底部不鋪Matrigel膠,其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn)：用標(biāo)記筆在6孔板背后均勻劃?rùn)M線,間隔0.5～1 cm,每孔至少穿過(guò)5條線。每孔加入約5×105個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,過(guò)夜,次日用移液槍槍頭垂直于板后的橫線劃痕,去除劃下的細(xì)胞。加入無(wú)血清培養(yǎng)基,放入5% CO2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),于0 h和48 h拍照。

1.3.7 EdU實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板,根據(jù)EdU染色試劑盒說(shuō)明書,用完全培養(yǎng)基將EdU稀釋到10μmol/L,每孔中加入100μL,孵育4 h后吸除培養(yǎng)基,用PBS清洗兩遍,多聚甲醛固定,Apollo染色,立即檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織和胃癌細(xì)胞系miR-140低表達(dá)qRTPCR檢測(cè)顯示,與癌旁組織相比,胃癌組織中miR-140表達(dá)顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖1A)。與GES-1正常人胃黏膜上皮細(xì)胞系相比,AGS、MKN45、MKN28、SGC7901、BGC823胃癌細(xì)胞系miR-140表達(dá)下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),其中SGC7901表達(dá)最低,AGS表達(dá)最高(圖1B)。在后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)中選擇SGC7901作為過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型,而AGS作為干擾的細(xì)胞模型。

圖1 胃癌組織和胃癌細(xì)胞系miR-140低表達(dá)

2.2 miR-140過(guò)表達(dá)抑制SGC7901細(xì)胞增殖 與模擬物NC轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞相比,miR-140模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-140表達(dá)水平更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖2A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,與模擬物NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,miR-140模擬物轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞增殖能力明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖2B)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-140模擬物轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞克隆形成能力明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2C)。EdU實(shí)驗(yàn)顯示,與模擬物NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,miR-140模擬物轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞DNA合成能力明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2D)。

圖2 miR-140過(guò)表達(dá)抑制SGC7901細(xì)胞增殖

2.3 miR-140過(guò)表達(dá)抑制SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞小室遷移實(shí)驗(yàn)顯示,miR-140模擬物轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞穿過(guò)小室基底膜的數(shù)目明顯少于轉(zhuǎn)染模擬物NC細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3A)。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,miR-140模擬物轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞后,穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3B)。劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-140模擬物的SGC7901細(xì)胞的遷移能力明顯弱于轉(zhuǎn)染模擬物NC細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖3C)。

圖3 miR-140過(guò)表達(dá)抑制SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲

2.4 干擾miR-140促進(jìn)AGS細(xì)胞增殖 將miR-140抑制劑和抑制劑NC轉(zhuǎn)染到AGS細(xì)胞中,與抑制劑NC轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞相比,miR-140抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miR-140表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖4A)。CCK-8試驗(yàn)顯示,與抑制劑NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,miR-140抑制劑轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4B)。克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與抑制劑NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,miR-140抑制劑轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞克隆形成能力明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖4C)。EdU實(shí)驗(yàn)顯示,與抑制劑NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,miR-140抑制劑轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞DNA合成能力明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4D)。

圖4 干擾miR-140促進(jìn)AGS細(xì)胞增殖

2.5 干擾miR-140促進(jìn)AGS細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞小室遷移實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染miR-140抑制劑的AGS細(xì)胞穿過(guò)小室基底膜的數(shù)目明顯多于轉(zhuǎn)染抑制劑NC的細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖5A)。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染miR-140抑制劑的AGS細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖5B)。劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-140抑制劑的AGS細(xì)胞遷移能力明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染抑制劑NC細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖5C)。

圖5 干擾miR-140促進(jìn)AGS細(xì)胞遷移和侵襲

3 討 論

在大多數(shù)惡性腫瘤中往往出現(xiàn)染色體斷裂、缺失、擴(kuò)增及染色體轉(zhuǎn)位等,導(dǎo)致抑癌基因失活和原癌基因過(guò)表達(dá)[11]。胃癌是分子和表型高度異質(zhì)性疾病[12],發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素包括幽門螺桿菌感染、年齡、高鹽攝入以及進(jìn)食水果和蔬菜偏少等。最近發(fā)現(xiàn)在美國(guó)25～39歲的非賁門胃癌發(fā)病率增加了70%[13],表明胃癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素仍需廣泛調(diào)查。另外,約10%胃癌表現(xiàn)為家族性聚集,1%～3%胃癌患者存在特定突變[14]。

研究證實(shí),除了編碼蛋白質(zhì)的mRNA,miRNA和癌癥發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[15],大量miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,它們參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、增殖和凋亡等過(guò)程[16]。癌癥相關(guān)miRNA可以分為致癌性miRNA和抑癌性miRNA[17-18],前者促進(jìn)癌癥發(fā)展,后者的作用相反。miR-200家族成員在乳腺癌中起著抑癌作用,阻止上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)miR-let-7在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中低表達(dá),可能與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),認(rèn)為血漿miR-320,miR-let-7e和miR-21是診斷視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的潛在生物標(biāo)志物[21-22]。在乳腺癌,骨肉瘤,結(jié)腸癌,肝細(xì)胞性肝癌和非小細(xì)胞肺癌中對(duì)miR-140生物學(xué)功能進(jìn)行研究[23-26],重點(diǎn)關(guān)注miR-140在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞惡性表型中的各種作用,如miR-140抑制乳腺癌干細(xì)胞自我更新和生長(zhǎng)[27],抑制食管癌細(xì)胞的侵襲[28]。

本研究發(fā)現(xiàn),與癌旁組織相比,胃癌組織中miR-140低表達(dá),提示miR-140在胃癌發(fā)展中起抑制作用,過(guò)表達(dá)miR-140可減弱SGC7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,而干擾miR-140則可增強(qiáng)AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,提示miR-140可能成為胃癌治療的新靶點(diǎn)。