彭帥,陳曉國,李曉光,李國文,李偉,李曹樂,郝迎志,黎佳茜*
1.武漢理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院 2.中國環(huán)境科學(xué)研究院 3.清華蘇州環(huán)境創(chuàng)新研究院
我國城市生活垃圾產(chǎn)生量巨大且與日俱增,據(jù)統(tǒng)計(jì),2006—2019年我國城市生活垃圾年清運(yùn)量從1.48億t增至2.42億t。城市生活垃圾成分較為復(fù)雜,主要由廚余廢物、塑料、紡織品、廢紙、木材、金屬、玻璃等組成[1-3]。常見的城市生活垃圾處理方式有焚燒、堆肥、填埋等,其中衛(wèi)生填埋是使用最為廣泛的一種方法,占城市生活垃圾總處理量的50%以上[4-5]。垃圾進(jìn)入填埋場(chǎng)后,經(jīng)過一系列的反應(yīng)最終礦化成為垃圾腐殖土。相關(guān)研究表明,腐殖土可利用性較強(qiáng),一般可用作生物填料處理廢水、植物栽種機(jī)質(zhì)、水泥窯替代原料或用于填埋場(chǎng)的覆蓋材料[6-9]。研究發(fā)現(xiàn),堆存過程中在細(xì)菌作用下垃圾腐殖土的性質(zhì)會(huì)發(fā)生較大的波動(dòng)[4],因此在進(jìn)行腐殖土綜合利用之前,了解其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。
垃圾在填埋過程中,大部分可降解組分逐漸轉(zhuǎn)化為填埋氣體或隨滲濾液排出,其余部分成為垃圾腐殖土,這個(gè)過程稱為垃圾填埋場(chǎng)的穩(wěn)定化。根據(jù)填埋場(chǎng)中固-液-氣相的變化特征,可以將填埋場(chǎng)的穩(wěn)定化過程分為5個(gè)階段,分別為初始階段、過渡階段、酸化階段、甲烷發(fā)酵階段和成熟階段[10-11]。微生物的代謝是整個(gè)過程中的主要驅(qū)動(dòng)力,與真菌和古菌相比,細(xì)菌(包括纖維素水解菌群、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群和產(chǎn)甲烷菌群)的參與程度更高[12-14]。近年來,大量研究人員應(yīng)用克隆文庫、宏基因組等生物學(xué)技術(shù)和方法,分析了填埋場(chǎng)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能,結(jié)果表明,厚壁菌門、放線菌門和變形菌門是填埋場(chǎng)中的優(yōu)勢(shì)菌門,且均對(duì)纖維素等多糖類物質(zhì)具有較強(qiáng)的分解能力[15]。此外,垃圾填埋場(chǎng)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與垃圾本身性質(zhì)(如含水率、總氮、總磷、pH等)有關(guān)。填埋年限也會(huì)影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),隨著填埋齡的增加,細(xì)菌群落多樣性也會(huì)發(fā)生變化,呈先增加后減少的趨勢(shì)[16-17]。垃圾腐殖土中存在不同程度的重金屬污染,而重金屬亦可顯著影響微生物的豐富度以及多樣性[18-19]。因此,研究不同填埋年限的垃圾腐殖土中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征,有助于進(jìn)一步解釋垃圾在填埋過程中的生化過程。
綜上所述,現(xiàn)有研究主要致力于探索垃圾滲濾液或填埋場(chǎng)周邊土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化,而關(guān)于垃圾腐殖土中的細(xì)菌群落研究相對(duì)較少,尤其是在重金屬的脅迫下,垃圾腐殖土中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與填埋年限的響應(yīng)關(guān)系?;诖?,筆者以江蘇省某生活垃圾填埋場(chǎng)中不同填埋年限的垃圾腐殖土及填埋場(chǎng)周邊土壤作為研究對(duì)象,系統(tǒng)分析細(xì)菌群落組成和變化規(guī)律,并闡明了腐殖土理化性質(zhì)和重金屬濃度對(duì)細(xì)菌群落的影響,以期為全面了解細(xì)菌群落在垃圾降解過程中的作用提供依據(jù)。
垃圾腐殖土樣品取自江蘇省某生活垃圾衛(wèi)生填埋場(chǎng),該填埋場(chǎng)占地17萬m2,總庫容726萬m3,設(shè)計(jì)日處理生活垃圾1 100 t,采用分區(qū)填埋,使用年限為15 a,于2005年底建成投入使用。于2020年11月對(duì)3個(gè)不同填埋年限的垃圾腐殖土進(jìn)行采樣,其中填埋年限1~3 a的區(qū)域記為A組,共設(shè)置2個(gè)點(diǎn)(A1、A2);填埋年限3~6 a的區(qū)域記為B組,共設(shè)置3個(gè)點(diǎn)(B1、B2、B3);填埋年限6~10 a的區(qū)域記為C組,共設(shè)置3個(gè)點(diǎn)(C1、C2、C3);此外,在填埋場(chǎng)周邊采集1份土壤樣品,記為D組(D1),采樣點(diǎn)布設(shè)如圖1所示。樣品采集深度均為地下50 cm處,按照四分法取約500 g樣品置于自密封塑料袋中低溫儲(chǔ)存。所有樣品一式2份,一份用于樣品理化性質(zhì)和重金屬濃度分析,一份用于測(cè)試細(xì)菌群落多樣性,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。
圖1 填埋場(chǎng)采樣點(diǎn)布設(shè)Fig.1 Landfill sampling points
將垃圾腐殖土樣品自然風(fēng)干,去除其中的碎玻璃、硬質(zhì)石塊、金屬等大塊垃圾,研磨后過100目篩,儲(chǔ)存于自密封塑料袋中。垃圾腐殖土的pH使用玻璃電極法測(cè)定,有機(jī)質(zhì)(OM)濃度使用馬弗爐于650 ℃灼燒后測(cè)定,總氮(TN)和總磷(TP)濃度用全自動(dòng)化學(xué)分析儀測(cè)定,重金屬Cd、Cr、Pb、Cu和Zn濃度用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定,Hg和As濃度用原子熒光分析儀測(cè)定。
使用FastDNA? Spin Kit for Soil對(duì)垃圾腐殖土中的微生物DNA樣品進(jìn)行提取,使用338F(ACTC CTACGGGAGGCAGCAG)和860R(GGACTACHVGG GTWTCTAAT)引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V4~V5區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用TransGen AP221-02:TransStart FastPfu DNA聚合酶,反應(yīng)體系包括4 μL 5×FastPfu的緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L的dNTPs、0.8 μL 5 μmol/L的正向引物、0.8 μL的5 μmol/L反向引物、0.4 μL的FastPfu聚合酶、0.2 μL的BSA和10 ng模板DNA。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃變性3 min;95 ℃持續(xù)30 s,55 ℃持續(xù)30 s,72 ℃持續(xù)45 s,循環(huán)29次;最后72 ℃延伸10 min,10 ℃直至停止。用試劑盒提取擴(kuò)增子在Illumina Miseq PE300平臺(tái)測(cè)序。
采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析,利用Mothur(1.30.2)對(duì)樣本進(jìn)行α多樣性分析,利用R語言對(duì)樣本進(jìn)行群落組成、物種Venn圖以及β多樣性分析?;赗語言的冗余分析(RDA)解析了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成與腐殖土理化性質(zhì)及重金屬濃度間的關(guān)系。數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
垃圾填埋場(chǎng)不同腐殖土樣品的理化性質(zhì)如表1所示。由表1可知,不同點(diǎn)位腐殖土pH均位于7.0~7.9,且隨著填埋年限的增長,pH呈微弱的減小趨勢(shì),填埋前期呈弱堿性,而超過6 a后,基本維持在中性。OM濃度從A組的51%~60%逐漸降到C組的10%~28%,而D組中OM濃度僅為8%,這主要是由于隨著填埋年限的增加,有機(jī)物逐漸被微生物分解為無機(jī)物[1]。隨著填埋年限的增加,TN濃度呈明顯的下降趨勢(shì),而TP濃度在1~3 a較高,3 a后其濃度相對(duì)填埋初期稍降低,但整體趨于穩(wěn)定,變化不明顯。
表1 不同點(diǎn)位樣品理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of samples at different points
不同腐殖土樣品中重金屬的濃度如表2所示。由表2可見,Zn、Cu、Cr、Pb、Cd、As和Hg的最高濃度分別為532.36、298.04、484.11、398.94、0.94、35.64和7.54 mg/kg,均超過GB 15618—2018《土壤環(huán)境質(zhì)量 農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》中的污染風(fēng)險(xiǎn)篩選值[20]。同時(shí),不同點(diǎn)位垃圾腐殖土中重金屬濃度均高于填埋場(chǎng)周邊土壤,表明腐殖土受到了一定程度的重金屬污染。該污染可能會(huì)對(duì)個(gè)別生物的生長產(chǎn)生一定的毒害作用,不僅直接影響土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),還可能通過食物鏈富集至人體,危害人類身體健康[21-24]。本研究中重金屬濃度分布與填埋年限未呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性,各點(diǎn)位的重金屬濃度之間存在較大差異,這可能與城市生活垃圾較為混雜有關(guān)。
表2 不同點(diǎn)位樣品重金屬濃度Table 2 Heavy metal concentrations of samples at different points mg/kg
利用α多樣性指數(shù)來反映垃圾腐殖土樣品中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性,結(jié)果如表3所示。由表3可見,所有樣品覆蓋度指數(shù)均大于98%,說明每個(gè)樣本序列檢測(cè)的概率足夠高,測(cè)序結(jié)果能夠反映樣本中微生物的真實(shí)情況。一般使用ACE和Chao指數(shù)估計(jì)樣本中OTU數(shù),這2個(gè)指標(biāo)的數(shù)值越高,表明其含有的物種總數(shù)越高,細(xì)菌群落豐富度越高[25]。隨著填埋年限增加,細(xì)菌群落豐富度呈現(xiàn)輕微上升的趨勢(shì),其中豐富度最高的為D1點(diǎn)位,即填埋場(chǎng)周邊的土壤,豐富度最低的為B1點(diǎn)位,填埋年限為3~6 a。通常利用Shannon和Simpson指數(shù)描述細(xì)菌群落多樣性,Shannon指數(shù)越高,Simpson指數(shù)越低,表明細(xì)菌群落的多樣性越高。不同填埋年限的垃圾腐殖土中,細(xì)菌群落多樣性差異不明顯,但均低于填埋場(chǎng)周邊的D1點(diǎn)位。α多樣性指數(shù)表明,與填埋場(chǎng)周邊土壤相比,填埋場(chǎng)中腐殖土細(xì)菌群落的多樣性和豐富度均有不同程度下降,這表明填埋的垃圾可能對(duì)細(xì)菌群落有一定的負(fù)面影響,導(dǎo)致細(xì)菌種類減少。另外,細(xì)菌群落多樣性指數(shù)隨著填埋年限增加有所上升,這可能是由于填埋過程中,大量有機(jī)物被降解,為微生物的生長發(fā)育提供了營養(yǎng)源,使細(xì)菌種類不斷增加[26]。
表3 不同點(diǎn)位樣品中細(xì)菌群落多樣性和豐富度指數(shù)Table 3 Bacterial community diversity and richness index of samples at different points
注:** 表示P< 0.01,*** 表示P< 0.001。圖2 不同填埋齡腐殖土的α多樣性組間差異Fig.2 Difference of α diversity among groups of humus soils at different ages of landfill
A、B、C、D各組樣品α多樣性組間差異性分析如圖2所示。由圖2可知,填埋場(chǎng)周邊的土壤與填埋年限為6~10 a的腐殖土之間細(xì)菌群落的α多樣性差異性較為顯著(P<0.01),與填埋年限為1~3和3~6 a的腐殖土之間差異性極為顯著(P<0.001)。不同填埋年限之間未呈現(xiàn)顯著差異(P>0.05),這可能是因?yàn)樵谔盥襁^程中細(xì)菌群落組成不斷發(fā)生改變,而部分細(xì)菌從填埋初期就一直存在于腐殖土中,并沒有隨填埋年限增加發(fā)生改變[27]。
Venn圖可以顯示不同填埋年限下垃圾腐殖土中特有和共有的OTU數(shù)差異(圖3)。由圖3(a)可見,A、B、C、D組的OTU數(shù)依次為 2 199、2 106、3 205 和 2 480,其中D組的特有性物種數(shù)目最大,OTU數(shù)高達(dá) 1 215;C組次之,特有OTU數(shù)為936;A組和B組特有OTU數(shù)分別為506和452。A、B組共有的OTU數(shù)為 1 171(27.2%),B、C組共有的OTU數(shù)為 1 211(21.1%),C、D組共有的OTU數(shù)為 1 136(20.0%)。從圖3(b)可以看出9個(gè)點(diǎn)位的共有OTU數(shù)為77,D1點(diǎn)位的特有OTU數(shù)(1 215)最大,B2點(diǎn)位的特有OTU數(shù)(18)最小。上述結(jié)果表明:不同填埋年限的垃圾腐殖土中OTU數(shù)不同,且隨著填埋年限的增長,會(huì)出現(xiàn)一些新的細(xì)菌種群,而部分細(xì)菌則參與了垃圾降解的整個(gè)過程,腐殖土中細(xì)菌群落的組成隨著垃圾的降解而不斷變化[1]。另外,在沒有垃圾堆存的D1點(diǎn)位中細(xì)菌的種類較多,這與α多樣性分析結(jié)論相一致。
圖3 不同填埋齡和不同點(diǎn)位樣品的細(xì)菌群落Venn圖Fig.3 Venn plots of bacterial communities in samples of different landfill ages and different sites
填埋場(chǎng)內(nèi)不同填埋年限腐殖土及周邊土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上的分布如圖4所示。厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidota)是主要的優(yōu)勢(shì)菌門,在腐殖土中相對(duì)豐度為75%~97%,在填埋場(chǎng)周邊的土壤中相對(duì)豐度為70%。在整個(gè)填埋過程中,放線菌門和變形菌門的比例無明顯變化,其相對(duì)豐度分別維持在20%和10%左右。厚壁菌門變化較為明顯,填埋初期其相對(duì)豐度較低(3%~11%),填埋中期相對(duì)豐度突增(37%~70%),填埋后期又開始下降(7%~29%)。綠彎菌門的變化趨勢(shì)與厚壁菌門恰好相反,在填埋初期相對(duì)豐度為14%~20%,填埋中期降至1%左右,填埋后期,其相對(duì)豐度又升到了22%~32%。對(duì)于擬桿菌門,在填埋初期和填埋中期,其相對(duì)豐度為5%~21%,在填埋后期相對(duì)豐度出現(xiàn)了下降,僅為2%左右。D1點(diǎn)位中厚壁菌門相對(duì)豐度較低(0.6%),酸桿菌門(Acidobacteria)相對(duì)豐度為14%,其余菌門分布與填埋后期較為相似。
圖4 不同點(diǎn)位的細(xì)菌在門水平上的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria at different points at the phylum level
相關(guān)研究表明,厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門是垃圾中的優(yōu)勢(shì)菌門,也是滲濾液中的優(yōu)勢(shì)菌門[28-29]。這3種菌群都具有較強(qiáng)的分解能力,其中厚壁菌門和擬桿菌門可以分解纖維素和淀粉,而變形菌門可以將可溶性糖降解為單糖和短鏈脂肪酸[30]。在本研究中,填埋年限為3~6 a的腐殖土中,厚壁菌門的相對(duì)豐度最高,可能在這個(gè)階段厚壁菌門新陳代謝較為迅速,在填埋后期纖維素等糖類物質(zhì)濃度相對(duì)較少,使得其相對(duì)豐度減小。同時(shí),擬桿菌門也表現(xiàn)出相對(duì)豐度逐漸減小的變化特征。綠彎菌門廣泛分布于生物圈各種生境中,形態(tài)多樣,營養(yǎng)方式和代謝途徑十分豐富,能夠參與C、N、S等一系列生物地球化學(xué)循環(huán)過程[31]。填埋年限為1~3和3~6 a的腐殖土中TN濃度呈逐漸下降趨勢(shì),這可能是由于綠彎菌門參與了N元素的循環(huán)過程。在填埋年限為6~10 a的腐殖土中綠彎菌門相對(duì)豐度增大,可能由于腐殖土中其他營養(yǎng)物質(zhì)刺激了綠彎菌門的生長,而關(guān)于其中機(jī)制仍然不明晰。
基于樣品中細(xì)菌門水平的相對(duì)豐度,對(duì)不同填埋年限的腐殖土以及填埋場(chǎng)周邊土壤中的微生物進(jìn)行非度量多維尺度(NMDS)分析(圖5)。由圖5可見,A、B和C 3組明顯互相分離,表明不同填埋年限下腐殖土中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性較大。D組與A組、B組的位置相隔較遠(yuǎn),與C組較為聚集,說明填埋場(chǎng)周邊土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與填埋年限1~3和3~6 a的腐殖土中差異較大,而與填埋年限6~10 a的腐殖土中較為接近。從各點(diǎn)位門水平細(xì)菌相對(duì)豐度可知,D1點(diǎn)位與C1、C2、C3點(diǎn)位較為相似,其中C3點(diǎn)位的理化性質(zhì)和重金屬濃度與D1點(diǎn)位差異較小,可能是由于D1點(diǎn)位靠近填埋場(chǎng)的滲濾液處理池,周邊土壤一定程度上受到了滲濾液的污染,因此,在填埋年限較長的腐殖土中,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出與周邊土壤相同的特征。另外,各組之間的點(diǎn)位離散程度較小,即各階段中,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似。
圖5 不同填埋齡細(xì)菌群落的非度量多維尺度分析Fig.5 Non-metric multidimensional scale analysis of bacterial communities at landfills of different ages
對(duì)表1和表2中的環(huán)境因子進(jìn)行去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(DCA),結(jié)果顯示排序軸梯度長度最大值為2.008,小于3.5,故選用線性模型較為合適。由于環(huán)境因子之間可能具有較強(qiáng)的多重共線性(相關(guān))關(guān)系[32],采用VIF方差膨脹因子分析,經(jīng)過篩選去除了Cr、TP和OM指標(biāo),綜合剩下的環(huán)境因子在門水平對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行RDA分析〔圖6(a)〕。由圖6(a)可見,前2個(gè)軸總共解釋了70.02%的群落變化,第一個(gè)軸解釋了59.42%,第二個(gè)軸解釋了10.60%。結(jié)果表明,填埋年限為1~3 a的腐殖土中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要受TN的影響,3~6 a的腐殖土主要受Cd、Zn和pH的影響,而6~10 a的腐殖土以及填埋場(chǎng)周邊土壤受Pb的影響較大。另外,C組和D組的樣本相互聚集,分布在原點(diǎn)附近,表明它們之間有較強(qiáng)的相關(guān)性,門水平的細(xì)菌群落組成以及NMDS分析也印證了這個(gè)結(jié)論。
國內(nèi)外大量研究表明,土壤的理化性質(zhì)和其中重金屬的濃度對(duì)微生物的群落組成具有顯著的影響[33-35]。pH作為垃圾降解程度的相關(guān)指標(biāo),是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要驅(qū)動(dòng)因素[36]。氮是微生物生長所需的重要元素之一,其濃度能夠顯著影響微生物的群落組成[37]。另外,重金屬還能夠影響微生物的α多樣性,對(duì)細(xì)菌的組成影響尤為嚴(yán)重[38]。當(dāng)環(huán)境中重金屬濃度較低時(shí),大部分細(xì)菌無反應(yīng)或反應(yīng)較弱;重金屬濃度較高時(shí),為了應(yīng)對(duì)生存威脅,細(xì)菌中可能會(huì)出現(xiàn)重金屬抗性基因(heavy metal resistance gene,MRGs),此時(shí)部分細(xì)菌會(huì)在重金屬的脅迫下死亡,而具有MRGs的細(xì)菌能進(jìn)行大量的繁殖,促使細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化[39]。在本研究中,Zn、Cd、TN和pH與細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)存在極顯著相關(guān)性(P<0.01),而腐殖土中Cu的濃度雖然較高,但對(duì)于細(xì)菌的影響相對(duì)較小。
結(jié)合重金屬(Zn、Cu、Pb、Cd、As、Hg)濃度以及腐殖土理化性質(zhì)(pH和TN),對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行了方差分解(VPA)分析〔圖6(b)〕。由圖6(b)可見,重金屬部分單獨(dú)解釋貢獻(xiàn)度占比為36%,理化性質(zhì)部分單獨(dú)解釋貢獻(xiàn)度占比為13%,共同解釋貢獻(xiàn)度占比為25%,未被這2種環(huán)境因子解釋到的殘差為26%,說明本研究中重金屬對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響能力較強(qiáng)。后續(xù)研究可以對(duì)細(xì)菌中的MRGs進(jìn)行檢測(cè),從而進(jìn)一步了解重金屬對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響機(jī)制。
圖6 門水平上細(xì)菌群落與環(huán)境因子的RDA分析和VPA分析Fig.6 RDA analysis and VPA analysis of bacterial community and environmental factors at phylum level
(1)垃圾腐殖土中有機(jī)質(zhì)和TN濃度隨填埋年限的增長不斷下降,而TP濃度變化不明顯。pH呈微弱的降低趨勢(shì),填埋初期為弱堿性,填埋后期降至中性。腐殖土受重金屬污染較為嚴(yán)重,其中Zn的濃度最高可達(dá)532.36 mg/kg,但重金屬的濃度與填埋年限未呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。
(2)腐殖土中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性隨填埋年限的增長逐漸增加,其中厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、綠彎菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌門,在整個(gè)填埋過程中相對(duì)豐度為74.7%~97.0%。不同填埋年限的腐殖土中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性較大,但填埋場(chǎng)周邊土壤中細(xì)菌群落分布與填埋年限為6~10 a的腐殖土較為類似,這可能與垃圾滲濾液對(duì)周圍土壤的污染有關(guān)。
(3)RDA分析表明,Zn、Cd、TN和pH與細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)存在極顯著相關(guān)性(P<0.01),VPA分析結(jié)果顯示,相對(duì)于理化性質(zhì),重金屬對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響能力較強(qiáng)。