基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的兒茶酚脅迫下釀酒酵母響應(yīng)機(jī)制

曾令杰,豐丕雪,黃錦翔,安佳星,趙雪梅,龍秀鋒,伍時(shí)華,易弋

(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院,廣西 柳州,545006)

隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,人類對(duì)能源的需求急劇增加,傳統(tǒng)化石燃料帶來的環(huán)境污染以及能源短缺問題日益嚴(yán)重,尋找和開發(fā)利用可再生的清潔型能源來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化石燃料已成為關(guān)注焦點(diǎn)之一[1]。燃料乙醇是一種理想的清潔生物燃料,可以通過木質(zhì)纖維素原料水解產(chǎn)物糖化和發(fā)酵生產(chǎn)。釀酒酵母因其具有生長周期短、發(fā)酵能力強(qiáng)等特性而被認(rèn)為是生產(chǎn)燃料乙醇的主要微生物。但是,由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)致密復(fù)雜、成分多樣,很難被酵母細(xì)胞直接利用,因此預(yù)處理是必不可少的環(huán)節(jié)。然而,預(yù)處理過程中會(huì)產(chǎn)生一系列木質(zhì)纖維素發(fā)酵抑制物,如酚類化合物、弱酸類和呋喃類[2]。它們常常會(huì)影響酵母細(xì)胞的生長和發(fā)酵酶系的正常功能,進(jìn)而降低發(fā)酵產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)率[3-4]。酚類化合物來源于木質(zhì)素的降解[5-6]、糖類物質(zhì)的分解[7],雖然含量比較低,但對(duì)細(xì)胞毒害作用比有機(jī)酸和呋喃類化合物更大。其中酚醛抑制物直接影響發(fā)酵菌株的乙醇發(fā)酵,酚酸和酚醇化合物通過影響菌體生長而間接影響乙醇發(fā)酵[8]。然而,由于缺乏酚類物質(zhì)準(zhǔn)確定性定量方法,目前對(duì)酚類化合物的毒性機(jī)制研究還不夠深入。有學(xué)者推測是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)能造成細(xì)胞膜損傷,使細(xì)胞膜的完整性喪失、選擇透過性的能力降低,從而影響酵母細(xì)胞的正常生長和發(fā)酵性能[9-10]。ZHANG等[11]研究酚類化合物可以抑制細(xì)胞內(nèi)酶的活性,使酵母念珠菌SB18內(nèi)木糖醇通路中有關(guān)酶失活。KEWELOH等[12]研究發(fā)現(xiàn)苯酚通過影響細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量的比例來改變細(xì)胞膜的功能。ISHIDA等[13]研究發(fā)現(xiàn)添加高濃度的香草醛能抑制細(xì)胞的翻譯過程,影響蛋白質(zhì)的生物合成,從而抑制釀酒酵母的生長和發(fā)酵。另外,酚類化合物的毒性強(qiáng)弱與其分子質(zhì)量大小以及取代基的位置有關(guān)。有研究指出,酚類物質(zhì)對(duì)木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵過程存在強(qiáng)烈的抑制[14-15],且分子質(zhì)量越低的酚類化合物毒性作用越強(qiáng)[16-17]。因此,如何解除酚類抑制劑對(duì)水解和發(fā)酵的不利影響是木質(zhì)纖維素產(chǎn)乙醇過程中的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。

兒茶酚是木質(zhì)纖維素水解液中常見的抑制物,但釀酒酵母應(yīng)對(duì)兒茶酚的響應(yīng)機(jī)制尚未闡明。本研究通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析,從mRNA水平揭示兒茶酚脅迫下釀酒酵母的響應(yīng)機(jī)制,為進(jìn)一步研究提高釀酒酵母酚類物質(zhì)耐受性的方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeGGSF16),由廣西科技大學(xué)微生物研究室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD)(g/L)：葡萄糖20,蛋白胨20,酵母粉10,115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖180,蛋白胨20,酵母粉10,115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑

兒茶酚(AR),天津市大茂化學(xué)試劑廠；RNA提取試劑盒,大連寶生物；DNA Marker,北京索萊寶科技有限公司；Tris,BioFroxx公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DY-6D 型DNA電泳儀,北京市六一儀器廠；ZWYD—2402型搖床,上海智誠分析儀器制造有限公司；H2100R離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠；456-GC氣相色譜儀,天美創(chuàng)科儀器(北京)有限公司；高效液相色譜儀,日本株式會(huì)社日立制作所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 兒茶酚對(duì)酵母細(xì)胞發(fā)酵力的測定

挑取一環(huán)酵母細(xì)胞接種于YPD培養(yǎng)基中,30 ℃,150 r/min,搖床培養(yǎng)14 h；按10%接種量接入新鮮的YPD中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(OD600=1.109),最后按10%接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,將兒茶酚加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中使其質(zhì)量濃度為1.2 g/L,以未添加兒茶酚的菌液為對(duì)照組,30 ℃,150 r/min培養(yǎng)24 h,每隔2 h取上清液適當(dāng)稀釋,用高效液相色譜儀檢測葡萄糖質(zhì)量濃度,用氣相色譜儀檢測乙醇質(zhì)量濃度。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序

將活化的菌種按2%接種量接種于YPD培養(yǎng)基,30 ℃,150 r/min搖床中培養(yǎng)至指數(shù)中期,將兒茶酚加入到Y(jié)PD培養(yǎng)基中,使其質(zhì)量濃度為1.2 g/L,并隨機(jī)分為對(duì)照組(ck1、ck2、ck3)和兒茶酚組(cat1、cat2、cat3),繼續(xù)培養(yǎng)2 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)RNA提取。取新鮮培養(yǎng)的菌液200 μL,參照酵母RNA提取試劑盒說明書提取RNA。質(zhì)量檢測合格的總RNA和mRNA用于后續(xù)建庫測序,轉(zhuǎn)錄組測序工作均在深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)處理及其生信分析

對(duì)測序所得到的原始數(shù)據(jù)(raw reads)首先去除含有接頭的Reads、未知堿基N含量過高、低質(zhì)量的reads得到clean reads,作為本研究的基本數(shù)據(jù)。將clean reads與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)以及利用表達(dá)定量軟件RSEM對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。使用DESeq2算法對(duì)樣品之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選,以P<0.05為差異值,fold change ≥2為差異倍數(shù)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選,并進(jìn)行差異基因的GO功能富集和KEGG代謝通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶酚對(duì)酵母細(xì)胞發(fā)酵的影響

為研究兒茶酚對(duì)酵母細(xì)胞的影響,本試驗(yàn)在1.2 g/L的兒茶酚培養(yǎng)條件下,測定了葡萄糖消耗及乙醇生成。由圖1可知,對(duì)照組在6～12 h葡萄糖消耗較快,18 h基本消耗完全,乙醇在6～16 h產(chǎn)量較多,并在18 h趨于穩(wěn)定；而在添加兒茶酚后,葡萄糖消耗延遲了4 h,即在10 h才開始消耗,乙醇生成含量明顯低于對(duì)照組,說明兒茶酚影響了酵母細(xì)胞乙醇發(fā)酵的性能,并延長了發(fā)酵周期。

圖1 兒茶酚對(duì)酵母細(xì)胞乙醇發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of catechol on ethanol fermentation of yeast cells

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

將原始數(shù)據(jù)經(jīng)過一系列數(shù)據(jù)處理來過濾雜質(zhì)得到過濾數(shù)據(jù)(clean data),如表1所示。每個(gè)樣品平均產(chǎn)出6.85 GB的過濾數(shù)據(jù),Q20、Q30均≥89%。用HISAT軟件將clean reads比對(duì)到參考基因組序列,如表2所示,每個(gè)樣品平均能比對(duì)到基因組中的reads數(shù)占總數(shù)的90.9%,比對(duì)上參考基因組唯一位置的clean reads比例占89.6%,說明測序結(jié)果基本達(dá)到可接受范圍,滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析的需求。

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 1 Quality of sequencing data

表2 參考基因組比對(duì)結(jié)果Table 2 Results of reference genome alignment

2.3 測序樣品相關(guān)性分析

對(duì)照組(ck)和兒茶酚組(cat)均有3個(gè)生物學(xué)重復(fù),共有6組轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。由圖2可知處理組與對(duì)照組間相關(guān)性系數(shù)約為0.92,平行樣品間相關(guān)系數(shù)為1或接近于1,說明樣品間重復(fù)性良好,兩組間差異相對(duì)較大,結(jié)果可信度高。

圖2 樣品相關(guān)性熱圖Fig.2 Heat map of sample correlation 注：圖中右側(cè)和下側(cè)為樣本名稱,對(duì)照組(ck1、ck2、ck3)和兒茶酚組 (cat1、cat2、cat3)；左側(cè)和上側(cè)為樣本聚類情況,不同顏色的方塊 代表兩個(gè)樣本的相關(guān)性高低

2.4 差異表達(dá)基因篩選

以q<0.05以及fold change ≥2為篩選條件,對(duì)兒茶酚組(cat)和對(duì)照組(ck)差異表達(dá)基因進(jìn)行檢測,如圖3所示,共篩選出223個(gè),其中上調(diào)基因172個(gè),下調(diào)基因52個(gè)。說明樣品間存在一定量的差異表達(dá)基因,且部分基因在差異對(duì)中表達(dá)量較大,結(jié)果也表明當(dāng)釀酒酵母受到兒茶酚脅迫時(shí),大部分基因在酵母細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了差異表達(dá)。

圖3 差異表達(dá)基因火山圖Fig.3 Volcano map of DEGs 注：Up代表上調(diào)差異表達(dá)基因,Down代表下調(diào)差異表達(dá)基因, no-DEGS非顯著差異基因

2.5 差異表達(dá)基因功能富集和信號(hào)通路分析

對(duì)篩選出進(jìn)行差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析,如圖4所示,橫坐標(biāo)為富集比例,縱坐標(biāo)為富集的GO term,氣泡的大小表示注釋到某個(gè)GO Term上的差異基因數(shù)目,顏色代表富集P值,顏色越深代表P值越小。差異表達(dá)基因主要富集在氧化還原過程、氧化還原酶活性、藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、抗氧化活性、谷胱甘肽代謝過程、半胱氨酸的生物合成過程、葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及鐵硫團(tuán)簇結(jié)合等通路。在生物體內(nèi),不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能,為了進(jìn)一步理解這些差異基因在代謝途徑里的變化情況,我們采用KOBAS在線分析工具進(jìn)行了KEGG信號(hào)功能注釋,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組(ck)與兒茶酚組(cat)共富集到67個(gè)信號(hào)通路,挑選富集最顯著的14條通路在圖形中進(jìn)行展示,如圖5所示,橫坐標(biāo)為富集比例,縱坐標(biāo)為KEGG Pathway,氣泡的大小表示注釋到某個(gè)KEGG Pathway上的基因數(shù)目,顏色代表富集p值,顏色越深代表P值越小。這些信號(hào)通路分析主要涉及到代謝途徑、碳代謝、硫代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、ABC(ATP-binding cassette) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及磷酸戊糖途徑等多條代謝通路。以上結(jié)果表明,兒茶酚脅迫下,釀酒酵母發(fā)生了氧化應(yīng)激,通過改變代謝途徑來適應(yīng)脅迫壓力,并加速碳代謝,為酵母抵抗脅迫提供能量以及提高胞內(nèi)抗氧化活性物質(zhì),從而抵抗兒茶酚的脅迫作用。

圖4 差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of DEGs

圖5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.5 KEGG pathway analysis of DEGs

3 討論

3.1 涉及硫代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因分析

在生物體中硫元素主要以半胱氨酸、谷胱甘肽形式存在,半胱氨酸能夠調(diào)控胞內(nèi)氧化還原水平,而且還是很多酶的關(guān)鍵氨基酸,參與了眾多代謝反應(yīng)[18-19]。谷胱甘肽是一類重要抗氧化物質(zhì),能夠?qū)⒒钚匝踝杂苫€原,生成氧化型谷胱甘肽以發(fā)揮抗氧化功能,保護(hù)細(xì)胞內(nèi)重要細(xì)胞器免受損傷[20]。在釀酒酵母中,可以通過硫代謝相關(guān)的途徑合成半胱氨酸和谷胱甘肽以發(fā)揮其生物學(xué)功能。本研究中,一些涉及硫代謝相關(guān)通路的基因出現(xiàn)了明顯的上調(diào),如ssu1、sul2、met16、met14、met5、met17、cys3、gsh1、gsh2、gex1、gex2、glr1等(表3)。ssu1和sul2分別編碼亞硫酸鹽/硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可以將胞外的硫酸鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi),增強(qiáng)了硫的吸收。有研究表明,當(dāng)酵母處于硫饑餓的情況下,sul2會(huì)過量表達(dá),如果添加合適的硫源,它們的表達(dá)量急劇下降[21]。met16、met14、met5、cys3與半胱氨酸的合成有關(guān),其中腺苷酰硫酸激酶和亞硫酸鹽還原酶的編碼基因met14和met5分別上調(diào)了2.24倍和1.46倍。met16編碼3′-磷酸腺苷硫酸還原酶基因的表達(dá)量顯著提高了3.08倍,該酶催化3′-磷酸腺苷硫酸鹽還原為腺苷-3′,5′-二磷酸鹽和游離亞硫酸鹽,參與硫酸鹽同化和甲硫氨酸代謝。半胱氨酸合成酶A和胱硫醚γ-裂解酶的編碼基因met17和cys3的表達(dá)量分別上調(diào)了1.77和1.59倍,這2個(gè)酶都參與了半胱氨酸的合成。由此看出,釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸含量的提高不僅與增強(qiáng)的硫吸收有關(guān),還與上調(diào)半胱氨酸合成相關(guān)的酶有關(guān),從而為谷胱甘肽的合成提供了充足的前體氨基酸。gsh1、gsh2、gex1、gex2這幾個(gè)基因參與了谷胱甘肽的合成,其表達(dá)量也顯著的提高。gsh1編碼γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶,該酶是谷胱甘肽合成代謝過程中的限速酶,催化谷胱甘肽生物合成的第一步,而在本實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量顯著上調(diào)2.16倍。有研究表明通過gsh1過表達(dá)使得GSH產(chǎn)量提高了約50%,說明gsh1表達(dá)量的提高有利于GSH的合成[22]。gsh2編碼谷胱甘肽合成酶,其表達(dá)量也上調(diào)了1.98倍,該酶催化由γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽。谷胱甘肽含量的提高不僅與關(guān)鍵前體氨基酸半胱氨酸的提高有關(guān),還和上調(diào)的限速酶編碼基因gsh1和gsh2有關(guān)。王立梅等[23]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母突變株在遭受內(nèi)源性活性氧過氧化氫的脅迫下,通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽合成限速酶活力加強(qiáng)了谷胱甘肽的合成。另外發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因gex1、gex2、glr1,分別編碼谷胱甘肽逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和谷胱甘肽還原酶,在谷胱甘肽逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用下,把谷胱甘肽轉(zhuǎn)運(yùn)到活性氧較多的細(xì)胞器加速活性氧的清除,同時(shí)生成氧化型谷胱甘肽,氧化型谷胱甘肽再被谷胱甘肽還原酶(GLR1)還原成還原性谷胱甘肽繼續(xù)參與抗氧化作用。KIM等[24]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)了谷胱甘肽合成途徑的基因gsh1和glr1,可以加強(qiáng)酵母細(xì)胞對(duì)糠醛的耐受能力。

3.2 涉及氧化還原相關(guān)的差異表達(dá)基因分析

通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析,發(fā)現(xiàn)一些參與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因表達(dá)量顯著提高(表3)。如編碼超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的基因sod1、sod2,SOD是釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶,其中sod1編碼含銅和鋅的超氧化物歧化酶存在細(xì)胞質(zhì)中,sod2編碼含錳的超氧化物歧化酶存在線粒體中,該酶能夠催化超氧負(fù)離子和H+的反應(yīng),生成O2和H2O2。上調(diào)基因ctt1、ira1編碼的過氧化氫酶作用下,將H2O2催化為H2O,從而清除兒茶酚脅迫下氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧。因此,猜測在兒茶酚脅迫下酵母細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧,釀酒酵母可以合成多種酶類來清除活性氧產(chǎn)生的毒性。

釀酒酵母為了降低兒茶酚對(duì)細(xì)胞的毒性作用,還可以通過上調(diào)功能還原酶和大量具有NAD(P)H依賴性還原酶的活性來實(shí)現(xiàn),本研究發(fā)現(xiàn)了一些顯著上調(diào)的基因(見表3),如ddi3、ddi2、oye3、oye2、ecm4,其中ddi3、ddi2、ecm4分別編碼氰胺水合酶、谷胱甘肽-氫醌還原酶,都顯著高表達(dá),DDI3、DDI2對(duì)氰胺具有解毒作用,ecm4能夠依賴性地將有毒的GS-三氯對(duì)苯二酚還原為三氯對(duì)苯二酚,因此猜測這3個(gè)基因參與了釀酒酵母對(duì)兒茶酚解毒作用。oye3、oye2編碼老黃酶,研究報(bào)道這2個(gè)基因可能在甾醇代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞程序性死亡中具有潛在作用[25]。另外有研究發(fā)現(xiàn)老黃酶可介導(dǎo)釀酒酵母對(duì)丙烯醛的抗性,而丙烯醛為生物系統(tǒng)中活性氧與生物膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物[26-27]。因此,認(rèn)為oye2、oye3在本研究中介導(dǎo)了由活性氧引起的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的抗性,從而解除此類化合物對(duì)細(xì)胞的毒性,提高釀酒酵母在兒茶酚脅迫下的耐受性。此外,研究發(fā)現(xiàn)一些重要的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因參與了釀酒酵母在兒茶酚脅迫下的調(diào)控作用,如pdr10、pdr5、pdr18、yor1、ycf1、snq2。其中pdr10、pdr18和pdr5編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起藥物/毒素轉(zhuǎn)運(yùn)和多藥物外排泵的作用,pdr10主要由Pdr1p和Pdr3p調(diào)節(jié),pdr5受Pdr1p積極調(diào)控的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,研究表明pdr10、pdr5在細(xì)胞排毒代謝和多效性耐藥過程起著重要的作用[28]?；谝陨辖Y(jié)果,可以推測釀酒酵母通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族將兒茶酚運(yùn)送到胞外進(jìn)行細(xì)胞排毒,從而介導(dǎo)釀酒酵母對(duì)兒茶酚的耐受性。

3.3 涉及碳代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因分析

釀酒酵母應(yīng)對(duì)兒茶酚的脅迫,消耗輔因子NAD(P)H和ATP導(dǎo)致氧化還原不平衡,從而使細(xì)胞代謝損傷,面對(duì)這樣的問題,釀酒酵母選擇了改變代謝途徑來適應(yīng)脅迫壓力。一些相關(guān)的基因表達(dá)水平發(fā)生了變化(表3),如zwf1、gnd1、gnd2、tdh1、err1、err3以及編碼鐵硫簇相關(guān)的基因nbp35、dre2、tah18、nar1、nfs1、isu2。其中zwf1編碼的6-磷酸葡萄糖脫氫酶,戊糖磷酸途徑的第一步反應(yīng),催化葡萄糖-6-磷酸生成磷酸葡萄糖酸-δ-內(nèi)脂,是酵母細(xì)胞中NADPH產(chǎn)生的主要途徑之一,參與適應(yīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)。而gnd1和gnd2編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶,該酶催化磷酸葡萄糖酸生成核酮糖-5-磷酸,在戊糖磷酸途徑中催化NADPH再生反應(yīng)。這2個(gè)限速酶通過磷酸戊糖途徑產(chǎn)生大量的NADPH,為細(xì)胞的各種合成反應(yīng)提供還原力,維持了細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平。編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶基因tdh1表達(dá)量上調(diào)了3.58倍,該酶主要參與糖酵解中催化3-磷酸甘油醛氧化成1,3-二磷酸甘油酸生成NADH。err1、err3編碼烯醇化酶,一種磷酸丙酮酸水合酶,催化2-磷酸甘油酸生成磷酸烯醇式丙酮酸,加速了磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化生成ATP。nbp35和isu2是鐵硫蛋白合成所需的線粒體蛋白,參與線粒體和胞質(zhì)蛋白的Fe-S簇組裝。nfs1編碼半胱氨酸脫硫酶,在鐵硫簇組裝中提供硫原子。nar1為胞質(zhì)鐵硫蛋白組裝的亞基,ZHAO等[29]報(bào)道,nar1缺失導(dǎo)致細(xì)胞壽命縮短和對(duì)百草枯的敏感性提高,對(duì)氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。

表3 兒茶酚脅迫下釀酒酵母應(yīng)答的相關(guān)基因Table 3 Related genes of S.cerevisiae response to catechol stress

tah18編碼NADPH依賴的二黃素氧化還原酶Ⅰ,它們參與了黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和生物合成,直接參與氧化還原過程,該過程將電子轉(zhuǎn)移到線粒體的電子傳輸鏈中并和Fe-S簇組裝蛋白(DRE2)之間的相互作用,對(duì)于調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和胞質(zhì)中Fe-S蛋白的合成至關(guān)重要,且DRE2-TAH18復(fù)合物可以防止H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[30]。由此可知,釀酒酵母在兒茶酚脅迫下,通過改變代謝途徑以及上調(diào)鐵硫蛋白合成相關(guān)的基因,在氧化應(yīng)激反應(yīng)中維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平和充足的能量發(fā)揮著重要的作用,從而提高了酵母細(xì)胞對(duì)兒茶酚的抵抗能力。

4 結(jié)論

釀酒酵母對(duì)木質(zhì)纖維素水解液抑制劑兒茶酚的適應(yīng)性和耐受性存在復(fù)雜的基因相互作用、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和協(xié)同調(diào)控。本研究在轉(zhuǎn)錄組水平上研究了釀酒酵母潛在的兒茶酚應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。兒茶酚脅迫下可引起釀酒酵母氧化性損傷,影響細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶活性,從而影響細(xì)胞的正常生長。釀酒酵母通過提高硫代謝途徑來響應(yīng)兒茶酚的脅迫,加強(qiáng)了半胱氨酸和谷胱甘肽的合成,在抗氧化、清除活性氧方面有著重要的作用；其次,通過上調(diào)涉及氧化還原相關(guān)功能酶的基因表達(dá)來響應(yīng)兒茶酚脅迫,從而清除酵母細(xì)胞內(nèi)過多的ROS,并在多種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用下對(duì)釀酒酵母細(xì)胞排毒；最后,通過加速碳代謝,為酵母抵抗脅迫提供能量以及維持細(xì)胞內(nèi)NAD(P)H水平,在酵母的適應(yīng)和能量再平衡中發(fā)揮作用,使酵母能夠生存和適應(yīng)兒茶酚脅迫。通過本研究探討釀酒酵母兒茶酚脅迫響應(yīng)機(jī)制,為進(jìn)一步研究提高釀酒酵母酚類物質(zhì)耐受性的方法提供理論指導(dǎo)意義。