細(xì)胞塊制備試劑盒在眼內(nèi)玻璃體液細(xì)胞學(xué)檢查中的應(yīng)用

陳淑霞，林健賢，高歡歡，唐麗娟，張文忻，李永平，張平

(中山大學(xué)中山眼科中心，中山大學(xué)眼科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510060)

以往針對(duì)臨床送檢的玻璃體液處理多以細(xì)胞涂片法和離心直接取細(xì)胞沉渣包埋法為主，但在長(zhǎng)期實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞涂片法會(huì)因?yàn)橥科癖〔痪霈F(xiàn)細(xì)胞堆積重疊、細(xì)胞分散、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不清，有背景染色等情況，造成閱片及診斷上的困難；離心直接取細(xì)胞沉渣包埋法對(duì)標(biāo)本量的要求比較大，適用于送檢量多且離心后肉眼可見細(xì)胞沉淀多的玻璃體切割液，不適合送檢量少或細(xì)胞量少的玻璃體液。隨著臨床對(duì)病理診斷要求的不斷提高[1-2]，將玻璃體液中的微量細(xì)胞沉淀制成細(xì)胞塊的技術(shù)運(yùn)用十分關(guān)鍵，它在細(xì)胞學(xué)研究與病理的診斷中起非常重要的作用[3-4]：不僅能為細(xì)胞學(xué)診斷提供更加完整的信息和清晰的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還可用于免疫組織化學(xué)染色，特殊染色等輔助檢測(cè)手段。本研究收集25例玻璃體液(包括玻璃體切割液)為研究對(duì)象，探討改良型細(xì)胞蠟塊的制作及染色在玻璃體液病理診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源

收集2020年9月至2021年1月臨床送檢至中山大學(xué)中山眼科中心臨床病理科的玻璃體液(含玻璃體切割液)25例。

1.1.2 儀器與試劑

低速離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠，干式恒溫器購(gòu)自昆明東環(huán)科技有限公司，全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，細(xì)胞塊制備試劑盒購(gòu)自昆明東環(huán)科技有限公司。

1.2 方法

標(biāo)本處理前，打開干式恒溫器進(jìn)行預(yù)熱，并將細(xì)胞塊制備試劑盒中配備的專用離心管置于干式恒溫器上(圖1)，使專用離心管中的基質(zhì)加熱熔化，保持在85 ℃?zhèn)溆?。接著處理?biāo)本及制作細(xì)胞塊：1)將臨床送檢的玻璃體液轉(zhuǎn)移至5 mL的離心管中，2000 r/min離心5 min；玻璃體切割液(混有組織塊時(shí)，需將組織塊取出單獨(dú)包埋)則分批轉(zhuǎn)移至50 mL的離心管中，2000 r/min離心5 min，吸去上清液，合并所有離心管的微量細(xì)胞沉渣，再次離心。2)離心完成后，用吸管吸去上清液，離心管內(nèi)留下細(xì)胞沉淀(此時(shí)混勻后涂片一張用于做對(duì)照)。3)之后加入5倍以上體積的細(xì)胞固定液，用吸管將細(xì)胞沉淀輕輕吹打成分散的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，預(yù)固定10 min。4)取出事先在干式恒溫器上預(yù)熱的專用離心管，基質(zhì)完全液化后，打開紅色離心管蓋，將預(yù)固定的細(xì)胞固定液混懸液加入專用離心管中，用吸管反復(fù)吹打使細(xì)胞混懸液和基質(zhì)充分混勻。加樣量：直徑8 mm專用離心管，加樣量約1000 μL；直徑4 mm專用離心管，加樣量約400 μL。5)趁熱立即離心，將離心管頭透明端向下，1500 r/min離心5 min。離心完成后，將專用離心管置于4 ℃冰箱10 min以上，使基質(zhì)充分凝固。6)取材：打開兩端離心管蓋，撕去密封膜，用棉簽將含有細(xì)胞的基質(zhì)推出離心管，用刀片切下3 mm厚細(xì)胞端，最下層細(xì)胞向下放入塑料包埋盒中(最下層細(xì)胞含有細(xì)胞團(tuán)和大細(xì)胞)。7)將制成的細(xì)胞塊在全封閉組織脫水機(jī)中進(jìn)行脫水，透明與浸蠟，用石蠟包埋機(jī)制備成細(xì)胞蠟塊，常規(guī)切片并行HE染色，必要時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色及特殊染色。

圖1 專用離心管置于干式恒溫器上加熱熔化Figure 1 Special centrifugal tube is heated in a dry thermostat

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察

經(jīng)過上述過程制作而成的細(xì)胞塊是呈果凍樣的圓柱膠體，經(jīng)處理后制備成蠟塊(圖2)，肉眼可見細(xì)胞塊與蠟融合良好，兩者之間未見裂隙。細(xì)胞蠟塊硬度好，包埋面形狀規(guī)則，切片完整(圖3)。

2.2 顯微鏡下觀察

與傳統(tǒng)涂片法對(duì)比，傳統(tǒng)涂片法制片后HE染色可見細(xì)胞成堆分布不均勻，細(xì)胞堆疊嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)欠清晰，難以區(qū)分細(xì)胞形態(tài)(圖4)。應(yīng)用試劑盒制備的細(xì)胞蠟塊制片后進(jìn)行HE 染色，效果好(圖5，6)，細(xì)胞數(shù)量分布適中，細(xì)胞之間分散且均勻平鋪，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)著色良好，連續(xù)切片中細(xì)胞成分分布均勻，背景干凈。

3 討論

玻璃體液細(xì)胞蠟塊制備是細(xì)胞學(xué)檢查重要的組成部分，是對(duì)細(xì)胞涂片診斷的有力補(bǔ)充，能滿足免疫組織化學(xué)染色和特殊染色檢測(cè)的需要，為提高細(xì)胞學(xué)診斷的正確性提供更多診斷依據(jù)[5-7]。目前針對(duì)細(xì)胞塊的制作技術(shù)并沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，在不同病理科及實(shí)驗(yàn)室所用的細(xì)胞塊制備技術(shù)不盡相同。本科室接收的玻璃體液標(biāo)本，根據(jù)切割液中細(xì)胞含量選擇直接離心取細(xì)胞沉渣包埋法或細(xì)胞塊制備試劑盒法。離心取細(xì)胞沉渣包埋法制備細(xì)胞蠟塊雖然是較為簡(jiǎn)單的方法，但適用于送檢量大且細(xì)胞沉淀多的玻璃體切割液，離心后沉淀物聚集不易分散；對(duì)于送檢量少或細(xì)胞量比較少的玻璃體液用此法制作細(xì)胞蠟塊制片后效果不佳，究其原因，離心沉渣法是直接取離心后的沉渣物進(jìn)行固定脫水包埋，由于沉渣物量少且細(xì)胞中間缺乏一定的支架，離心時(shí)細(xì)胞難以聚集成團(tuán)，且在利用吸管將離心管底部的微量沉渣轉(zhuǎn)移至包埋紙的過程中，沉渣碎裂，吸管及離心管附著較多細(xì)胞，脫水后包埋紙中仍貼附有部分細(xì)胞[8]，導(dǎo)致最后細(xì)胞的富集效果不理想，從而影響制片與診斷。

細(xì)胞塊制備試劑盒法直接彌補(bǔ)了離心取細(xì)胞沉渣包埋法的不足之處，能將送檢量少細(xì)胞量少的玻璃體液制作成細(xì)胞蠟塊，防止細(xì)胞丟失。此方法中的關(guān)鍵基質(zhì)材料與瓊脂糖作用相似，首先將專用離心管加熱使基質(zhì)液化，用液態(tài)基質(zhì)作為分離富集的介質(zhì)材料，降低溫度后，冷卻凝固的固態(tài)基質(zhì)作為支架材料，將在液態(tài)條件下分離富集的細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)，支撐凝固在特定的空間位置。瓊脂糖包埋法是文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道中使用較多的方法，但由于該方法存在需現(xiàn)配瓊脂、溫度和濃度不易掌握，操作步驟繁瑣，操作過程受人為的影響因素大等缺點(diǎn)，沒有在玻璃體液細(xì)胞學(xué)檢查中進(jìn)行廣泛應(yīng)用。而細(xì)胞塊制備試劑盒法操作步驟簡(jiǎn)單，通過溫度和時(shí)間的可控，最大限度地避免人為操作帶來的誤差，提高標(biāo)本制片滿意率。另外，試劑盒中配有兩種不同內(nèi)徑的專用離心管，當(dāng)送檢的玻璃體液沉渣物較多時(shí)，可選擇內(nèi)徑8 mm的專用離心管進(jìn)行制備細(xì)胞塊。當(dāng)送檢的玻璃體液沉渣物較少時(shí)，使用小內(nèi)徑的專用離心管能夠?qū)⑽⑿?biāo)本聚集制作成細(xì)胞塊。

采用細(xì)胞塊制備試劑盒技術(shù)制作的細(xì)胞蠟塊，有如下優(yōu)點(diǎn)：可對(duì)微量標(biāo)本進(jìn)行處理，提高利用率；制備的細(xì)胞塊完整，基質(zhì)與石蠟之間無裂痕；細(xì)胞塊切片順暢，滿足標(biāo)本連續(xù)切片，為免疫組織化學(xué)染色、特殊染色等檢測(cè)提供豐富的切片，有利于后續(xù)的診斷和研究；并可永久保存標(biāo)本。但應(yīng)用過程中應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：1)當(dāng)送檢的玻璃體液離心后沉渣物肉眼不易觀察時(shí)，應(yīng)適當(dāng)提高離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)或多次離心富集，直至滿足要求。2)若送檢的眼內(nèi)液體外觀是紅色或深紅色，則需要向細(xì)胞沉渣物中加入5倍以上的紅細(xì)胞裂解工作液，消除大量紅細(xì)胞造成的背景干擾，有利于提高腫瘤細(xì)胞或炎癥細(xì)胞等的檢出率。3)用小吸管輕柔地將細(xì)胞混懸液與基質(zhì)充分混勻后，應(yīng)該立即趁熱離心。此步驟需快速完成，否則溫度降低，細(xì)胞與基質(zhì)凝膠體沒有離心便先形成凝固，影響細(xì)胞的分離富集效果。4)待基質(zhì)凝膠體凝固后，用棉簽推出，棉絮輕軟，有利于保護(hù)細(xì)胞不受擠壓、基質(zhì)凝膠體不易破碎等。5)由于細(xì)胞是有序分布，大細(xì)胞，高核質(zhì)比細(xì)胞，細(xì)胞團(tuán)在最下層，因此必須將細(xì)胞塊的最下端作為包埋面，包埋時(shí)應(yīng)輕夾輕放，切片時(shí)應(yīng)輕修少修，以免造成細(xì)胞的損失。6)試劑盒制備的細(xì)胞蠟塊制片做免疫組織化學(xué)染色前，烤片時(shí)間適當(dāng)加長(zhǎng)、溫度設(shè)為65 ℃以上，使細(xì)胞有效黏附于玻片上，防止脫片。

綜上所述，應(yīng)用細(xì)胞塊制備試劑盒處理眼內(nèi)玻璃體液的操作過程簡(jiǎn)單方便，可連續(xù)切片，不僅滿足常規(guī)病理診斷的需求，還可用于后續(xù)免疫組織化學(xué)染色和特殊染色的檢測(cè)，為臨床提供了有價(jià)值的細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果。