連作草莓低發(fā)病土壤與高發(fā)病土壤理化性質(zhì)及生物學(xué)特征差異比較

李夢(mèng)雅 陳莎莎 王世梅

摘要： 為探索連作草莓低發(fā)病土壤形成的機(jī)制，本研究通過(guò)對(duì)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）孢子萌發(fā)率以及連作土壤理化性質(zhì)的測(cè)定，結(jié)合Real-time PCR及高通量測(cè)序?qū)δ暇┙紖^(qū)多年連作草莓大棚低發(fā)病土壤和高發(fā)病土壤的理化性質(zhì)及生物學(xué)特征進(jìn)行比較，分析其微生物群落特征。結(jié)果表明，低發(fā)病土壤中尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率明顯低于高發(fā)病土壤。二者理化性質(zhì)亦呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，低發(fā)病土壤 pH、EC、總碳含量、總氮含量和總磷含量均高于高發(fā)病土壤，低發(fā)病土壤的大團(tuán)聚體（>0.250 mm）比例及土壤過(guò)氧化氫酶活性顯著高于高發(fā)病土壤。Real-time PCR及高通量測(cè)序結(jié)果顯示，低發(fā)病土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著低于高發(fā)病土壤，且低發(fā)病土壤中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、游動(dòng)放線菌屬（Actinoplanes）等類群的豐度顯著高于高發(fā)病土壤。因此，低發(fā)病土壤的形成與土壤理化性質(zhì)、土壤中病原菌的數(shù)量及潛在有益微生物的種類和豐度密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 草莓;低發(fā)病土壤;高發(fā)病土壤;尖孢鐮刀菌;團(tuán)聚體;土壤酶活性;微生物群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)： S154.3?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?? 文章編號(hào)： 1000-4440（2021）04-0910-09

Contrast of physicochemical properties and biological characteristics of low disease and high disease soils of continuous cropping strawberry

LI Meng-ya， CHEN Sha-sha， WANG Shi-mei

（Jiangsu Provincial Key Laboratory of Solid Organic Waste Utilization/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization/Research Center of Resource-saving Fertilizer Engineering Technology， Ministry of Education， Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095， China）

Abstract： In order to explore the formation mechanism of low disease soil of continuous cropping strawberries， the low disease soil and high disease soil samples were collected from a greenhouse for continuous cropping strawberry in Nanjing suburb to compare the physicochemical and biological characteristics of the above two kinds of soils and analyze the features of microfloras， based on detection of the spore germination rate of Fusarium oxysporum and physicochemical characteristics of continuous cropping soil， combined with Real-time PCR and high-throughput sequencing. The result showed that， the spore germination rate of F. oxysporum in low disease soils was obviously lower than that in the high disease soils. The physicochemical characteristics of the soils also presented different change rules， the pH value， EC， total carbon content， total nitrogen content and total phosphorus content of low disease soils were higher than those of high disease soils. The proportion of macro aggregates （>0.250 mm） and soil catalase activities in low disease soils were also significantly higher than those in high disease soils. Results of Real-time PCR and high-throughput sequencing indicated that， the number of F. oxysporum in low disease soils was significantly lower than that in high disease soils， while the abundances of Sphingomonas， Flavobacterium， Paenibacillus and Actinoplanes in low disease soils were obviously higher than those in high disease soils. Therefore， the formation of low disease soils is closely related to the physicochemical properties， pathogen abundance and the variety and abundance of potential beneficial microorganism in the soils.

Key words： strawberry;low disease soil;high disease soil;Fusarium oxysporum;aggregates;soil enzyme activity;microbial community structure

由于集約化農(nóng)業(yè)的發(fā)展，果蔬連作現(xiàn)象普遍存在。在多年連作條件下，土傳病害嚴(yán)重，發(fā)病率高的土壤稱作高發(fā)病土壤（High disease soil，HDS），有的文獻(xiàn)稱此類土壤為導(dǎo)病型土壤（Conducive soil），而有些土壤，雖然連作多年，但是植物發(fā)病率依然較低，此類土壤稱作低發(fā)病土壤（Low disease soil，LDS），有的文獻(xiàn)也稱該類土壤為抑病型土壤（Suppressive soil）[1]。低發(fā)病或抑病型土壤很早就被發(fā)現(xiàn)在世界各地均有所分布，如Cook等[2]在美國(guó)西北太平洋地區(qū)發(fā)現(xiàn)抑制小麥全蝕病病原菌（Gaeumanon-myces graminis var.tritici，禾頂囊殼小麥變種）的土壤、Meng等[3]在美國(guó)密歇根州發(fā)現(xiàn)抑制馬鈴薯瘡痂病病原菌（Streptomyces scabies， 病原鏈霉菌）的土壤。為了促進(jìn)植物健康生長(zhǎng)，農(nóng)業(yè)科技工作者會(huì)采取各種措施改變土壤性質(zhì)，其中最綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的方法就是土壤自身調(diào)節(jié)，低發(fā)病土壤就是土壤自身調(diào)節(jié)最典型的產(chǎn)物。關(guān)于低發(fā)病或抑病型土壤的形成機(jī)制研究尚不深入，文獻(xiàn)報(bào)道土壤的理化性質(zhì)如有機(jī)質(zhì)含量、pH、礦物質(zhì)以及水分、溫度等非生物因子均可影響土壤微生物數(shù)量與種類，進(jìn)而影響植物病害的發(fā)生[4-5]。Benizri等[6]研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落組成及結(jié)構(gòu)是土壤抑病能力形成的關(guān)鍵，隨著連作時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤微生物生態(tài)平衡遭到破壞，使得大部分連作土壤轉(zhuǎn)化為高發(fā)病土壤[6-7]，但仍有少部分連作土壤抗病性依然較強(qiáng)[8]。

草莓根腐病是由于草莓連作引起的根部土傳病害，已成為草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙，其病原菌包括尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、疫霉（Phytoqhthora fragariae）等，其中尖孢鐮刀菌是主要的病原菌[9] 。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治草莓根腐病的措施有土壤消毒、輪作等，化學(xué)藥劑處理對(duì)土壤環(huán)境有污染，輪作效果好，但難以適應(yīng)設(shè)施農(nóng)業(yè)種植模式的要求[10]，生物防控是一項(xiàng)綠色環(huán)保的重要技術(shù)[11]。2014-2016年我們?cè)谀暇┙紖^(qū)傅家邊農(nóng)業(yè)種植園進(jìn)行草莓根腐病生物防控田間試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)傅家邊多年連作草莓園有高發(fā)病大棚，也有低發(fā)病大棚。因此，通過(guò)采樣分析高發(fā)病及低發(fā)病大棚土壤抑制尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的能力，測(cè)定土壤理化性質(zhì)，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)分析2類土壤微生物區(qū)系特征，探討連作草莓低發(fā)病土壤形成的機(jī)制，以期為防控草莓連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

土壤采集于南京傅家邊農(nóng)業(yè)生態(tài)園，土壤類型為黃棕壤。采集低發(fā)病土壤（發(fā)病率在10%～15%，草莓連作5～8年），高發(fā)病土壤（發(fā)病率達(dá)60%左右，草莓連作5～10年），各選取3個(gè)低發(fā)病大棚（LDS-1，LDS-2，LDS-3），3個(gè)高發(fā)病大棚（HDS-1，HDS-2，HDS-3），每個(gè)大棚采集3個(gè)混合樣，每個(gè)混合樣由5個(gè)相距2 m的2 m×2 m大小的取樣點(diǎn)采集的土樣組成，采集離草莓根系較近的土壤混合。采樣時(shí)間為2017年11月底，將采集的新鮮土壤裝于無(wú)菌牛皮紙袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試菌株

草莓根腐病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）Y3由本實(shí)驗(yàn)室分離保存[12]。

1.3 連作草莓低發(fā)病土壤與高發(fā)病土壤對(duì)F. oxysporum Y3 孢子萌發(fā)的影響

在PDA平板上接種F. oxysporum Y3，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，用無(wú)菌水洗滌，無(wú)菌脫脂棉漏斗過(guò)濾，制備Y3 的孢子懸浮液，并調(diào)整孢子含量為1×103CFU/ml。取風(fēng)干后磨碎的土壤樣品各30 g于90 mm培養(yǎng)皿中，加入適量無(wú)菌水使土濕潤(rùn)，28 ℃平衡3 d。利用真空抽濾裝置將50 ml的孢子懸浮液吸附于濾膜（0.45 μm）上，加蓋玻璃片后將其埋于土壤平板中間，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出玻璃片置于顯微鏡（×400）下觀察Y3的孢子萌發(fā)情況，每個(gè)處理3次重復(fù)，每重復(fù)隨機(jī)觀察3～5個(gè)不同的視野，統(tǒng)計(jì)每100個(gè)孢子中的萌發(fā)數(shù)量，計(jì)算萌發(fā)率 [13]。

1.4 土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定

新鮮土壤樣品風(fēng)干，磨碎，過(guò)80目篩，在105 ℃烘干至恒質(zhì)量。利用Elementar公司元素分析儀通過(guò)干燒法測(cè)定土壤的總碳（TC）含量、總氮（TN）含量及碳氮比（C/N）。利用消解-鉬銻抗分光光度法測(cè)定土壤總磷（TP）含量[14]，利用電導(dǎo)率測(cè)定儀（DDS-307A 型）測(cè)定土壤電導(dǎo)率（EC），利用雷磁（E-201-C型）pH計(jì)測(cè)土壤pH值。

1.5 土壤團(tuán)聚體分布測(cè)定

將采集的土壤樣品自然風(fēng)干，稱取40～50 g風(fēng)干土壤放置自上而下孔徑為2.000 mm，0.250 mm和 0.053 mm套篩上，放入水中并全部浸沒(méi)，靜置10 min，隨后將其置于濕篩機(jī)（FT-3型電動(dòng)團(tuán)粒分析器）上，上下振幅為3 cm，頻率為1 min 30次，時(shí)間為5 min。收集粒徑>2.000 mm、2.000～0.251 mm、0.250～0.053 mm、<0.053 mm的4種土壤團(tuán)聚體并分別轉(zhuǎn)移至鋁盒中，105 ℃烘干稱質(zhì)量，計(jì)算各粒級(jí)團(tuán)聚體的質(zhì)量百分比。

1.6 土壤過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定

采用土壤過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒測(cè)定酶活性，試劑盒購(gòu)自蘇州科銘公司。

1.7 土壤細(xì)菌、真菌及尖孢鐮刀菌 Real-time PCR擴(kuò)增

采用MOBIO試劑盒提取土壤樣品微生物總DNA并于-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用Nanodrop 200超微量分光光度計(jì)檢測(cè)土壤DNA含量。采用 TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒于ABI（Applied BIO systems）PRISM 7500 Real-time PCR Systems擴(kuò)增儀上對(duì)DNA樣品進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，土壤細(xì)菌、真菌及尖孢鐮刀菌的通用引物分別參照文獻(xiàn)[15]～[17]。反應(yīng)體系為20.0 μl： SYBR Premix Ex Taq TM（2×）10.0 μl，上下游引物各0.4 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50×） 0.4 μl，模板DNA 1.0 μl，ddH2O 7.8 μl。細(xì)菌通用引物USU-F：5′-AACTGGAGGAAGGTGGGGA-3′，USU-R：5′-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3′;真菌通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′;尖孢鐮刀菌通用引物W106R：5′-GCAGTCGTACGTCATCGACC-3′，W106S：5′-CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3′，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，細(xì)菌55 ℃ 30 s（真菌為61 ℃，尖孢鐮刀菌為 60 ℃），72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.8 土壤細(xì)菌與真菌高通量測(cè)序

土壤DNA樣品送至上海凌恩生物科技有限公司完成土壤細(xì)菌與真菌高通量測(cè)序。MiSeq測(cè)序流程：基因組DNA提取，設(shè)計(jì)并合成引物接頭，PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化，PCR產(chǎn)物定量和均一化，MiSeq PE文庫(kù)構(gòu)建，MiSeq高通量測(cè)序。細(xì)菌16 S rRNA擴(kuò)增引物341F：5′- CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′;真菌ITS 擴(kuò)增引物ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS2R：5′- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與物種相對(duì)豐度分析，用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析與差異顯著性檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)定為P<0.05。采用Qiime 1.7.0 軟件計(jì)算Shannon、Chao等多樣性指數(shù)，OTU（Operational taxonomic units）利用R 語(yǔ)言 “vegan”包基于Bray-curits距離進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作草莓低發(fā)病土壤與高發(fā)病土壤對(duì)尖孢鐮刀菌Y3孢子萌發(fā)的影響

將平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察尖孢鐮刀菌Y3孢子萌發(fā)情況并計(jì)算其萌發(fā)率（圖1、表1）。高發(fā)病土壤中Y3孢子萌發(fā)率明顯高于低發(fā)病土壤，高發(fā)病土壤孢子萌發(fā)率均高于50%，其中HDS-1最高，達(dá)到了75.75%;在低發(fā)病土壤中， LDS-2、LDS-3對(duì)Y3孢子萌發(fā)具有很強(qiáng)的抑制作用，而Y3孢子在LDS-1中萌發(fā)率較高，表明LDS-1的抑菌能力下降。

2.2 連作草莓低發(fā)病土壤與高發(fā)病土壤基本理化性質(zhì)差異比較

由表2可知，低發(fā)病土壤pH與高發(fā)病土壤差異不顯著。各土壤樣品電導(dǎo)率值為400～850 μS/ml，除LDS-1外，低發(fā)病土壤電導(dǎo)率顯著高于高發(fā)病土壤。低發(fā)病土壤的總碳含量和總氮含量高于高發(fā)病型（LDS-1除外），低發(fā)病土壤碳氮比低于高發(fā)病土壤。低發(fā)病土壤的總磷含量高于高發(fā)病土壤且差異顯著。

2.3 連作草莓低發(fā)病與高發(fā)病土壤團(tuán)聚體粒徑分布比較

土壤大團(tuán)聚體含量的高低能夠很好地反映土壤保持和供應(yīng)養(yǎng)分能力的強(qiáng)弱。由表3可知，低發(fā)病土壤大團(tuán)聚體（>2.000 mm、2.000～0.251 mm）比例高于高發(fā)病土壤，而高發(fā)病土壤小團(tuán)聚體比例 （0.250～0.053 mm、<0.053 mm ）高于低發(fā)病土壤，其中LDS-1的團(tuán)聚體分布類似高發(fā)病土壤，可見(jiàn)低發(fā)病土壤團(tuán)聚體趨向于大粒徑，高發(fā)病土壤團(tuán)聚體更趨向于小粒徑。但是LDS-1的大團(tuán)聚體（>2.000 mm 、2.000～0.251 mm ）比例顯著小于LDS-2及LDS-3，而與HDS-2類似。綜合土壤抑菌能力及團(tuán)聚體粒徑分布情況，推測(cè)LDS-1趨向高發(fā)病型土壤轉(zhuǎn)化。

2.4 土壤基本理化性質(zhì)、團(tuán)聚體分布與 F. oxysporum Y3孢子萌發(fā)率相關(guān)性分析

將6種土壤樣品的基本理化性質(zhì)、團(tuán)聚體分布和F. oxysporum Y3孢子萌發(fā)率進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。總氮含量與F. oxysporum Y3孢子萌發(fā)率呈極顯著負(fù)相關(guān)，土壤養(yǎng)分中的總碳含量與大團(tuán)聚體（2.000～0.251 mm）比例呈顯著正相關(guān)，EC和總氮含量與大團(tuán)聚體（2.000～0.251 mm）呈正相關(guān)。F. oxysporum Y3孢子萌發(fā)率與大團(tuán)聚體（>2.000 mm、2.000～0.251 mm）呈顯著負(fù)相關(guān)，與小團(tuán)聚體（0.250～0.053 mm）呈極顯著正相關(guān)。說(shuō)明豐富的土壤養(yǎng)分有助于大團(tuán)聚體的形成及穩(wěn)定，而且土壤抑菌能力和土壤團(tuán)聚體組成與穩(wěn)定也存在較好的正相關(guān)性。

2.5 連作草莓低發(fā)病土壤與高發(fā)病土壤過(guò)氧化氫酶活性比較

土壤過(guò)氧化氫酶活性是評(píng)價(jià)土壤抗病性的重要指標(biāo)。由圖2可知，低發(fā)病土壤LDS-2、LDS-3過(guò)氧化氫酶活性高于高發(fā)病土壤，低發(fā)病土壤過(guò)氧化氫酶活性最高可達(dá)到 17.88 μmol/（d·g），是高發(fā)病土壤的1.76～2.22倍，說(shuō)明土壤過(guò)氧化氫酶活性增加對(duì)土壤抑病有積極作用。

2.6 連作草莓低發(fā)病土壤與高發(fā)病土壤主要微生物數(shù)量比較

由表5可知，低發(fā)病土壤細(xì)菌數(shù)量總體上略高于高發(fā)病土壤（HDS-2除外），真菌數(shù)量顯著高于高發(fā)病土壤，而高發(fā)病土壤中，尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著高于低發(fā)病土壤，說(shuō)明低發(fā)病土壤的形成與尖孢鐮刀菌數(shù)量密切相關(guān)。

2.7 連作草莓低發(fā)病土壤與高發(fā)病土壤細(xì)菌及真菌群落結(jié)構(gòu)差異比較

原始序列經(jīng)過(guò)抽提分配之后，18個(gè)土壤樣品共有843 300條16 S rRNA和811 149條ITS優(yōu)質(zhì)序列，經(jīng)抽平后，在97%相似度水平下16 S rRNA序列共有8 128個(gè)OTU，而ITS序列共有1 375個(gè)OTU。在97%的相似水平上利用Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)對(duì)樣品中細(xì)菌及真菌物種豐度和多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，低發(fā)病土壤和高發(fā)病土壤細(xì)菌和真菌Chao指數(shù)及Shannon指數(shù)差異均不顯著，物種豐富度和物種多樣性差異不大。

基于Bray-curits距離的主成分分析結(jié)果（圖3）表明，低發(fā)病土壤與高發(fā)病土壤中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)均在第1軸（PCA1）和第2軸（PCA2）存在差異。通過(guò)使用方差置換分析發(fā)現(xiàn)，二者土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性差異均極顯著（P<0.01），說(shuō)明低發(fā)病土壤與高發(fā)病土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)相似度低。

2.8 連作草莓低發(fā)病與高發(fā)病土壤細(xì)菌及真菌群落組成差異比較

在門分類水平上，樣本的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門及真菌門組成類似，差異主要體現(xiàn)在豐度上（圖4）。在細(xì)菌門水平，土壤中主要的細(xì)菌門類群是變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、綠彎菌門（Chloroflexi）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）等，其中豐度最高的是變形菌門，占20%～30%。低發(fā)病土壤中變形菌門，擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門，棲熱菌門豐度顯著高于高發(fā)病土壤，而酸桿菌門，奇古菌門豐度低于高發(fā)病土壤。土壤中主要的真菌門包括子囊菌門（Ascomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、芽枝霉門（Blastocladiomycota）及毛霉亞門（Mucoromycota），其中子囊菌門豐度最高，占60%～90%。低發(fā)病土壤中子囊菌門，壺菌門豐度顯著高于高發(fā)病土壤，而擔(dān)子菌門豐度低于高發(fā)病土壤。

在屬分類水平上，優(yōu)勢(shì)菌屬和相對(duì)豐度如圖5A所示，豐度較高的是Gaiellales_norank和Saccharibacteria_norank，在低發(fā)病土壤和高發(fā)病土壤中差異均不顯著。低發(fā)病土壤中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomons）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、游動(dòng)放線菌屬（Actinoplane）、氣單胞菌屬（Arenimonas）、亞棲熱菌屬（Meiothermus）、玫瑰彎菌屬（Roseiflexus）豐度顯著高于高發(fā)病土壤，且文獻(xiàn)報(bào)道鞘氨醇單胞菌屬[18-19]、黃桿菌屬[20]、類芽孢桿菌屬[21]和游動(dòng)放線菌屬[22]屬中有益微生物，種群豐富，這些潛在的有益微生物種群可能是抑制土壤發(fā)病的重要因素之一，說(shuō)明土壤的抑病能力形成與有益功能微生物種群及豐度有關(guān)。真菌優(yōu)勢(shì)菌屬和相對(duì)豐度見(jiàn)圖5B。低發(fā)病土壤中豐度最大的是彎孢屬（Curvularia）、梭孢殼屬（Thielavia）、曲霉屬（Aspergillus）和鐮刀菌屬（Fusarium），約占 50%～60%，且Curvularia、青霉屬（Penicillium）、皮司霉屬（Pithomyces）豐度顯著高于高發(fā)病土壤，鐮刀菌屬的豐度在低發(fā)病與高發(fā)病土壤中差異不顯著。高發(fā)病土壤中梭孢殼屬、裸傘屬（Gymnopilus）、嗜熱鏈球菌屬（Mycothermus）豐度顯著高于低發(fā)病土壤，梭孢殼屬所占豐度比例最大，約為 20%～30%。值得注意的是鐮刀菌屬在LDS-3中豐度是最大的，綠僵菌屬（Metarhizium）在LDS-1中豐度最大。

3 討論

本研究通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證了在低發(fā)病土壤中病原菌（尖孢鐮刀菌）孢子萌發(fā)率顯著低于高發(fā)病土壤，且低發(fā)病土壤與高發(fā)病土壤的理化性質(zhì)亦呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。適宜草莓生長(zhǎng)的土壤pH值為5.8～6.5[23]，本試驗(yàn)中各土壤樣品pH值雖均屬于草莓可生長(zhǎng)的酸堿范圍內(nèi)，但總體上低發(fā)病土壤pH值高于高發(fā)病土壤，后者呈現(xiàn)酸化趨勢(shì)。土壤團(tuán)聚體的形成受到土壤理化性質(zhì)及生物學(xué)特性的影響[24]，土壤粒徑分布結(jié)果顯示，低發(fā)病土壤的大團(tuán)聚體（>0.250 mm）含量顯著高于高發(fā)病土壤，且土壤抑菌能力與土壤團(tuán)聚體組成與穩(wěn)定存在較好的正相關(guān)性。土壤中的有機(jī)碳，總氮和總磷等是土壤的主要養(yǎng)分，其含量在一定程度上影響了土壤團(tuán)聚體的形成與穩(wěn)定[25]。分析發(fā)現(xiàn)低發(fā)病土壤的EC值、總碳含量、總氮含量和總磷含量均高于高發(fā)病土壤，總氮含量與尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率呈極顯著負(fù)相關(guān)，土壤的EC和總氮含量與大團(tuán)聚體呈正相關(guān)。這表明低發(fā)病土壤中養(yǎng)分含量高于高發(fā)病土壤，豐富的土壤養(yǎng)分可促進(jìn)土壤大團(tuán)聚體的形成，塑造良好的土壤結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)土壤抑病作用。

土壤酶活性是反映土壤中各種生物化學(xué)綜合作用的重要指標(biāo)之一[26-28]。土壤過(guò)氧化氫酶可促進(jìn)H2O2分解，降低H2O2對(duì)土壤中的生物及作物的毒害作用，試驗(yàn)中低發(fā)病土壤LDS-2、LDS-3過(guò)氧化氫酶活性高于高發(fā)病土壤，表明過(guò)氧化氫酶活性的增加對(duì)土壤抑病有積極作用。需要說(shuō)明的是，在3個(gè)低發(fā)病土壤中LDS-1很特殊，其草莓根腐病發(fā)病率雖然低于15%，但是病原菌孢子萌發(fā)率和土壤團(tuán)聚體分布均近似于高發(fā)病土壤，且LDS-1的過(guò)氧化氫酶活性與3個(gè)高發(fā)病土壤的酶活性亦相當(dāng)，表明低發(fā)病土壤與高發(fā)病土壤不是一成不變的，可以轉(zhuǎn)變，LDS-1很有可能正在向高發(fā)病土壤轉(zhuǎn)化。

土壤微生物是土壤中最活躍的有機(jī)體，而微生物群落結(jié)構(gòu)失衡是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)、土壤質(zhì)量退化的主要原因之一[29-32]。研究發(fā)現(xiàn)高發(fā)病土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著高于低發(fā)病土壤。文獻(xiàn)報(bào)道土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量決定著植物枯萎病發(fā)生的程度，通常認(rèn)為該病原菌數(shù)量的增長(zhǎng)會(huì)加重枯萎病病害的發(fā)生[33]。沈宗專[34]通過(guò)主成分分析發(fā)現(xiàn)連作香蕉抑病型（低發(fā)?。┩寥赖募?xì)菌與真菌群落結(jié)構(gòu)都明顯不同于導(dǎo)病型（高發(fā)病）土壤，與本研究結(jié)果相似。分析結(jié)果表明，在門分類水平上，2類土壤主要菌群種類基本相似，其主要差異表現(xiàn)在菌群的豐度上。在屬水平上低發(fā)病土壤中含量較高的鞘氨醇單胞菌屬豐度顯著高于高發(fā)病土壤，鞘氨醇單胞菌屬是一種解毒菌屬，對(duì)稠環(huán)芳烴、有機(jī)氯農(nóng)藥具有獨(dú)特的降解能力，對(duì)有機(jī)磷、氨基甲酸酯、除蟲酯也有很強(qiáng)的降解作用[18-19]。其次在低發(fā)病土壤中具有抗菌作用的功能性微生物類芽孢桿菌屬、黃桿菌屬和游動(dòng)放線菌屬[20-22]的豐度也顯著高于高發(fā)病土壤，這些潛在的有益微生物可能是抑制土傳病害發(fā)生的重要因素，進(jìn)一步說(shuō)明土壤抑病能力的形成與有益功能菌群和病原菌的豐度密切相關(guān)。研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解低發(fā)病土壤形成的機(jī)制，為防控土傳病害提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張瑞福，沈其榮. 抑病型土壤的微生物區(qū)系特征及調(diào)控[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 35（5）： 125-132.

[2] COOK R J， ROVIRA A. The role of bacteria in the biological control of Gaeumannomyces graminis by suppressive soils[J]. Soil Biology and Biochemistry， 1976， 8（4）： 269-273.

[3] MENG Q， YIN J， ROSENZWEIG N， et al. Culture-based assessment of microbial communities in soil suppressive to potato common scab[J]. Plant Disease， 2012， 96 （5）： 712-717.

[4] 小林紀(jì)彥，朱熙樵. 抑病土壤及其抑病機(jī)制[J]. 世界農(nóng)業(yè)， 1988（1）： 42-43.

[5] 謝卓霖，李 蕓，溫云躍，等. 抑菌土在作物病害防治中的作用機(jī)制與土壤抑菌能力的測(cè)定方法[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015（11）： 67-70.

[6] BENIZRI E， PIUTTI S， VERGER S， et al. Replant diseases： bacterial community structure and diversity in peach rhizosphere as determined by metabolic and genetic fingerprinting[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2005， 37（9）： 1738-1746.

[7] 蔡燕飛，廖宗文，章家恩，等. 生態(tài)有機(jī)肥對(duì)番茄青枯病及土壤微生物多樣性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2003， 14（3）： 349-353.

[8] WELLER D M， RAAIJMAKERS J M， GARDENER B B M， et al. Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens[J]. Annual Review of Phytopathology， 2002， 40： 309-348.

[9] 曾富春，黃 云，趙艷琴，等. 草莓枯萎病菌的生物學(xué)特性[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2006，24（2）：156-160.

[10]肖 蓉，鄧 舒，張春芬，等. 連作草莓根際土壤特征及修復(fù)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2014， 30（19）：81-85.

[11]沈 婷，楊 華，王世梅，等. 吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）B04固體菌劑對(duì)草莓生長(zhǎng)及果實(shí)品質(zhì)影響的研究[J]. 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2016，33（1）：49-54.

[12]沈 婷，張園園，王 辰，等. 白刺鏈霉菌（Streptomyces albospinus）CT205菌株固體發(fā)酵及防控草莓根腐病的研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 38（4）： 596-601.

[13]吳小雙，張亞波，吳盼盼，等. 溫濕度及土壤類型對(duì)土壤中綠僵菌孢子萌發(fā)的影響[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)， 2014（6）：766-771.

[14]鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2000：71-76.

[15]郭 吉，浦躍樸，尹立紅，等. 太湖溶藻細(xì)菌的分離及評(píng)價(jià)[J]. 東南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2006， 36（2）： 293-297.

[16]PITZSCHKE A. Developmental peculiarities and seed-borne endophytes in quinoa： omnipresent， robust bacilli contribute to plant fitness[J]. Frontiers in Microbiology， 2016， 7（482）： 2.

[17]張吉祥，凌 鍵，謝丙炎，等. 甘藍(lán)枯萎病菌1號(hào)和2號(hào)生理小種的快速檢測(cè)與鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2014， 44（6）： 586-594.

[18]歐陽(yáng)主才，王奕恒，李小妮，等. 鞘氨醇單胞菌株XJ對(duì)農(nóng)藥的降解效能[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 29（2）： 47-49.

[19]CHO O， CHOI K Y， ZYLSTRA G J， et al. Catabolic role of a three-component salicylate oxygenase from Sphingomonas yanoikuyae B1 in polycyclic aromatic hydrocarbon degradation[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2005， 327（3）： 656-662.

[20]王 曦. 愛(ài)媛類芽孢桿菌南京分離株的鑒定及其體內(nèi)外的抑菌活性[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2009.

[21]SANG M K， KIM K D. The volatile-producing Flavobacterium johnsoniae strain GSE09 shows biocontrol activity against Phytophthora capsici in pepper[J]. Journal of Applied Microbiology， 2012， 113（2）： 383-398.

[22]李一青，李艷瓊，李銘剛，等. 稀有放線菌產(chǎn)生的抗生素[J]. 中國(guó)抗生素雜志， 2008， 33（4）： 193-197.

[23]張秀剛. 草莓基礎(chǔ)生理及其栽培[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社， 1993.

[24]MONREAL C M， SCHULTEN H R， KODAMA H. Age， turnover and molecular diversity of soil organic matter in aggregates of a Gleysol[J]. Canadian Journal of Soil Science， 1997， 77： 379-388.

[25]王清奎，汪思龍. 土壤團(tuán)聚體形成與穩(wěn)定機(jī)制及影響因素[J].土壤通報(bào)，2005，36（3）：415-421.

[26]高雪峰，韓國(guó)棟，張 功，等. 荒漠草原不同放牧強(qiáng)度下土壤酶活性及養(yǎng)分含量的動(dòng)態(tài)研究[J]. 草業(yè)科學(xué)， 2007， 24（2）： 10-13.

[27]盧維宏，張乃明，張 麗，等. 增效肥料對(duì)設(shè)施栽培小白菜生長(zhǎng)及土壤酶活性的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019， 50（9）：2022-2028.

[28]徐 彬，徐 健，祁建杭，等. 江蘇省設(shè)施蔬菜連作障礙土壤理化及生物特征[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，35（5）：1124-1129.

[29]INSAM H， MITCHELL C C， DORMAAR J F. Relationship of soil microbial biomass and activity with fertilization practice and crop yield of three ultisols[J]. Soil Biology and Biochemistry， 1991， 23（5）： 459-464.

[30]趙 帆，趙密珍，王 鈺，等. 草莓不同連作年限土壤養(yǎng)分及微生物區(qū)系分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 45（16）： 110-113.

[31]祖韋軍，潘文杰，張金召，等. 耕作深度與翻壓綠肥對(duì)植煙土壤微生物功能多樣性及酶活性的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020， 51（10）：2383-2393.

[32]馬 麗，齊紅志，閆 明，等. 生物炭對(duì)連作障礙條件下土壤微生物和草莓生長(zhǎng)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（17）：142-146.

[33]何 欣，黃啟為，楊興明，等. 香蕉枯萎病致病菌篩選及致病菌濃度對(duì)香蕉枯萎病的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 43（18）： 3809-3816.

[34]沈宗專. 抑制香蕉土傳枯萎病土壤的微生物區(qū)系特征及調(diào)控[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.

（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-11-13

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFD0500201）;國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41671256）

作者簡(jiǎn)介：李夢(mèng)雅（1997-），女，安徽宿州人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橥寥牢⑸?。（E-mail）2018103126@ njau.edu.cn

通訊作者：王世梅，（E-mail）smwang@njau.edu.cn