添加乳酸菌和纖維素酶對(duì)砂仁葉青貯品質(zhì)的影響

鄭明揚(yáng)，吳 碩，郭 香，陳曉陽(yáng)，張 慶

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東木本飼料工程技術(shù)研究中心，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州, 510642)

砂仁(Amomumvillosum)屬于姜科豆蔻屬多年生草本植物，是我國(guó)“四大南藥”之一，收錄于《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)[1]。原產(chǎn)地中國(guó)，品種主要有‘陽(yáng)春砂’、‘綠殼砂’和‘海南砂’[2]。現(xiàn)代科學(xué)表明砂仁有一定的胃腸保護(hù)、抗?jié)儭㈡?zhèn)痛、消炎、止瀉、抑菌和抗氧化作用等[3]。Wang和Zhang等[4-5]報(bào)道砂仁精油能顯著降低胃酸、胃蛋白酶活性，抑制胃酸分泌和細(xì)菌增殖，保護(hù)胃腸粘膜，調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)。砂仁主要成份為揮發(fā)性成分，次要成分為非揮發(fā)性成分。其揮發(fā)油主要由醋酸冰片(5%～47%)、樟腦(4%～17%)、冰片(1.5%～6%)等組成。非揮發(fā)性成分主要由多糖、皂苷類、黃酮類、有機(jī)酸、酚類等組成[6-7]。砂仁擁有非常多的有益活性成分，可作為飼料添加。李喬仙等[8]發(fā)現(xiàn)砂仁鮮莖葉適口性好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，可作為牛、羊等草食動(dòng)物的青貯飼料。韓建成等[9]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加10%的砂仁莖葉，對(duì)雷州黑山羊的生長(zhǎng)有積極作用。閆長(zhǎng)東[10]發(fā)明了一種新型砂仁飼料(最外層由砂仁粉構(gòu)成)，能提高家禽的食欲和提高飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

青貯前期pH值能否快速下降對(duì)青貯品質(zhì)影響至關(guān)重要。通過(guò)添加乳酸菌制劑能迅速降低pH值，乳酸菌在發(fā)酵前期與其他菌種競(jìng)爭(zhēng)中獲得優(yōu)勢(shì)并抑制有害微生物的活性從而提升青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)[11]。纖維素酶和木聚糖酶等酶制劑常用于改善粗飼料的青貯品質(zhì)[12]。添加纖維素酶，能使纖維水解為葡萄糖[13]，增加乳酸菌的發(fā)酵底物。木聚糖酶可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素。同時(shí)添加乳酸菌和纖維素酶，能幫助pH快速下降，這也是青貯技術(shù)發(fā)展的一種熱門趨勢(shì)[14]。

當(dāng)前對(duì)砂仁的研究主要集中在揮發(fā)油成分的鑒定上，而對(duì)精油提取后殘?jiān)睦藐P(guān)注較少。將提取完砂仁精油后的砂仁葉殘?jiān)鳛榍噘A飼料的原料，可以提高砂仁的利用價(jià)值，有效緩解家畜飼料短缺的情況[15]，對(duì)砂仁葉殘?jiān)鳛榍噘A飼料原料方面，也暫無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)提取精油之后的砂仁葉添加乳酸菌和纖維素酶進(jìn)行青貯處理，來(lái)探究添加不同濃度的纖維素酶和乳酸菌，或者纖維素酶和乳酸菌同時(shí)添加對(duì)砂仁葉青貯品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

砂仁葉為精油提取后的剩余材料，由陽(yáng)江市百盛園實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)贈(zèng)予。纖維素酶和木聚糖酶均購(gòu)于湖南盛東生物科技有限公司，纖維素酶的酶活為2×104U·g-1、木聚糖酶的酶活為2×105U·g-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素一為是否添加乳酸菌LF，添加的劑量為1×106cfu g-1鮮樣(Fresh matter，F(xiàn)M)，因素二為不同的酶處理(分別為0.3%纖維素酶、0.6%纖維素酶、0.2%木聚糖酶、0.4%木聚糖酶)。砂仁葉切碎(長(zhǎng)約2 cm)進(jìn)行青貯處理，添加乳酸菌LF(參照Z(yǔ)hang[16]的研究篩選所得)和不同水平的酶制劑，共10組，每組3個(gè)重復(fù)，共30袋青貯。CK為對(duì)照組(添加等量純水)。飼料混合均勻后，放入實(shí)驗(yàn)室聚乙烯袋(20 cm×30 cm)，然后用真空封口機(jī)進(jìn)行封口，放置在室溫下。青貯30 d后開(kāi)袋，測(cè)定砂仁葉青貯品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的各項(xiàng)指標(biāo)。測(cè)定方法參照王成[17]的研究并加以適當(dāng)修改和補(bǔ)充。

1.3 微生物及化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

30 d開(kāi)袋后，取10 g樣品與90 mL滅菌后的生理鹽水(0.9% NaCl)充分混合，之后取1 mL浸取液加入裝有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，以此方法依次將濃度稀釋為10-2到10-6倍的浸取液。分別用配制好的MRS瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基(Violet red bile agar,VRBA)和孟加拉紅培養(yǎng)基(虎紅瓊脂)培養(yǎng)乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)、大腸桿菌、酵母菌以及霉菌，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算各自數(shù)量(培養(yǎng)基均來(lái)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。測(cè)定pH值和有機(jī)酸含量的方式為：取10 g樣品與90 mL滅菌后的生理鹽水充分混合，于4℃冰箱中放置18 h后取出通過(guò)濾紙進(jìn)行過(guò)濾，采用雷磁PHS-3C型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定pH值[18]。剩余液體用0.22 μm孔徑的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，測(cè)定乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)含量(島津GC-14型高效液相色譜儀)[19]。

1.4 纖維和蛋白含量的測(cè)定

中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)含量的測(cè)定：參照Van Soest的方法[20]進(jìn)行測(cè)定。

可溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates,WSC)的測(cè)定采用蒽酮比色法[21]。

粗蛋白質(zhì)(Crude protein,CP)含量的測(cè)定：依據(jù)凱氏定氮法[22]，準(zhǔn)確稱量0.5 g砂仁葉干粉，加入適量濃硫酸和催化劑(硫酸鉀和硫酸銅按5∶1的比例配置)進(jìn)行消煮，用凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定。

真蛋白質(zhì)(True protein,TP)含量的測(cè)定：稱取0.5 g砂仁葉干粉，加入15%的三氯乙酸浸泡1 h，再用定性濾紙(無(wú)氮)進(jìn)行過(guò)濾，將殘?jiān)鼰o(wú)損的轉(zhuǎn)移到濾紙上，把殘?jiān)B同濾紙一起烘干，按照CP的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，即能測(cè)出真蛋白質(zhì)的含量[23]。

非蛋白氮(Non-protein nitrogen,NPN)的含量：根據(jù)計(jì)算公式：NPN=CP-TP，測(cè)定CP和TP的含量后即可計(jì)算非蛋白氮的含量[23]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 19.0 進(jìn)行雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，當(dāng)需要分析兩個(gè)因素的交互作用時(shí)，采用Duncan法對(duì)各組進(jìn)行比較，P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料的特點(diǎn)

由表1可知：砂仁葉青貯飼料干物質(zhì)(Dry matter，DM)含量為28.3%；粗蛋白質(zhì)含量為14.9% DM；NDF含量為70.2% DM；ADF含量為43.3% DM；WSC的含量為4.30% DM。乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌、霉菌數(shù)量分別為7.48，5.55，6.79和<2.00 log10cfu g-1FM。

表1 青貯原料的特點(diǎn)(± SD,n=3)

2.2 砂仁葉青貯30 d的青貯品質(zhì)

由表2可知砂仁葉青貯30 d的青貯品質(zhì)。添加LF和酶制劑(纖維素酶和木聚糖酶)，導(dǎo)致pH值極顯著降低(P<0.01)，LA的含量極顯著增加(P<0.01)。添加LF，LAB的數(shù)量略有降低，AA的含量極顯著降低(P<0.01)；有害微生物方面，添加酶制劑后，酵母菌數(shù)量極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明，添加LF和酶制劑以及同時(shí)兩種處理的交互作用對(duì)pH，LA，AA和LAB的含量都有極顯著影響(P<0.01)。

表2 砂仁葉青貯30 d的青貯品質(zhì)(n=3)

2.3 砂仁葉青貯30 d的營(yíng)養(yǎng)成分

表3 砂仁葉青貯30 d的營(yíng)養(yǎng)成分(n=3)

3 討論

3.1 青貯原料的特點(diǎn)

砂仁葉原料中的DM含量接近30%，高于趙苗苗[25]報(bào)道的象草DM含量(20.43%)和劉剛等[26]報(bào)道的玉米DM含量(16.36%～27.14%)，根據(jù)Jessie[27]的報(bào)道30%～35%的DM含量最適合青貯。原料中WSC含量為4.30% DM，低于smith[28]的研究中所提到的優(yōu)質(zhì)青貯標(biāo)準(zhǔn)，WSC含量較低可能導(dǎo)致發(fā)酵底物不足，乳酸菌難以快速繁殖。若乳酸菌不能快速增殖并與有害微生物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成為優(yōu)勢(shì)菌群，可能會(huì)引起有害微生物的快速增殖進(jìn)而引起有氧腐敗[29]。根據(jù)李茂等[30]報(bào)道，熱帶灌木的NDF和ADF的平均值分別為38.83%，33.67%，而本試驗(yàn)中砂仁葉原料的纖維含量特別是NDF含量遠(yuǎn)大于這個(gè)平均值，說(shuō)明砂仁葉纖維含量高，會(huì)影響飼料的適口性，纖維素酶的添加可在一定程度上降低NDF含量，為乳酸菌發(fā)酵提供底物。原料中乳酸菌的含量達(dá)到了7.48 lg cfu·g-1FM，高于Cai[31]報(bào)道的良好青貯飼料的標(biāo)準(zhǔn)(>5.0 lg cfu·g-1FM)，但是大腸桿菌的含量較高(6.79 lg cfu g-1FM)可能會(huì)影響飼料的青貯品質(zhì)。

3.2 砂仁葉青貯30 d的青貯品質(zhì)

pH值是衡量青貯品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)[32]，當(dāng)pH值高于4.2時(shí)，可能會(huì)有更多腐敗現(xiàn)象的產(chǎn)生[33]。本試驗(yàn)中最高pH值為4.26，其余處理組均低于4.2，說(shuō)明本試驗(yàn)中的添加劑處理使砂仁葉達(dá)到較好的青貯品質(zhì)。本試驗(yàn)中LAB數(shù)量減少可能是由于酸化過(guò)快導(dǎo)致pH值快速降低，使一些不耐酸的LAB活性受到抑制，Parvin和Nishino[34]也報(bào)道了類似的結(jié)果。LF的添加使LAB在青貯前期取得優(yōu)勢(shì)競(jìng)爭(zhēng)地位，纖維素酶的添加使纖維水解，給乳酸菌增加了可發(fā)酵的WSC含量，所以LF和酶制劑的處理組中，LA的含量顯著增加，這與Ebrahimi[35]報(bào)道的結(jié)果一致。酵母菌的產(chǎn)生可能代表著有氧腐敗的開(kāi)始[36-37]，酶制劑添加組中的酵母菌數(shù)量明顯減少，可能是較低的pH值對(duì)酵母菌有抑制作用。同時(shí)，本試驗(yàn)中未見(jiàn)大腸桿菌和霉菌產(chǎn)生，說(shuō)明青貯效果良好。

3.3 砂仁葉青貯30 d后的營(yíng)養(yǎng)成分

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)中，砂仁葉本身的纖維含量高，WSC含量較低，單獨(dú)青貯難度較大。添加纖維素酶能將纖維素分解為WSC，解決了乳酸菌發(fā)酵底物不足的問(wèn)題。試驗(yàn)結(jié)果表明：添加LF和2種纖維素酶使砂仁葉青貯的乳酸明顯增加，而pH值、乙酸、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、氨態(tài)氮的含量明顯降低，并且抑制了有害微生物酵母菌、大腸桿菌和霉菌。結(jié)果表明同時(shí)添加LF和0.6%纖維素酶或者同時(shí)添加LF和0.4%木聚糖酶都能明顯提高砂仁葉的青貯品質(zhì)，說(shuō)明精油提取后的砂仁葉殘?jiān)軌蛟倮弥谱髑噘A飼料，提高了農(nóng)副產(chǎn)品利用率。