前列腺素EP4受體激動劑HY-128686對實(shí)驗(yàn)性缺血性腦梗死的神經(jīng)保護(hù)作用*

羅彩琴 荊 忻 沈 佳 馬曉薇 朱金源

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，銀川 750004）

腦梗死是常見致死疾病之一，其中87%為缺血性腦梗死[1-2]。缺血性腦梗死由大腦主要動脈閉塞導(dǎo)致，從動脈支配的中心區(qū)細(xì)胞壞死持續(xù)到周圍半影區(qū)[3]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）異常生成會激活金屬基質(zhì)蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）[4-5]。MMP-9 通 過 破壞血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的完整性，引起免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和滲透，加速組織損傷[6-8]。研究表明MMP 在炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)血管損傷中至關(guān)重要，而敲除或抑制MMP-9 表達(dá)可以顯著降低腦缺血后的神經(jīng)血管損傷[9-10]。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是4 個G 蛋白偶聯(lián)受體EP1-EP4 的內(nèi)源性配體，具有旁分泌或自分泌效應(yīng)，對炎癥信號至關(guān)重要[11]。缺血性腦梗死后，磷脂酶從膜上釋放大量花生四烯酸，然后進(jìn)一步代謝為包括PGE2 的幾種前列腺素進(jìn)而導(dǎo)致血腦屏障通透性改變和周圍免疫細(xì)胞滲透[12-14]。HY-128686 是有效的、選擇性、可口服的前列腺素E2 受體亞型4（EP4）激動劑。它對EP4 的選擇性比其他類前列腺素受體高4 000 倍[15]。有研究顯示EP4 激活能夠通過cAMP 及Wnt 等信號通路促進(jìn)CD34+細(xì)胞的抗凋亡和增殖作用以減少炎癥及促進(jìn)血管生成等作用[16]。本研究旨在通過檢測在短暫性局灶性腦缺血的臨床相關(guān)動物模型中使用EP4 受體激動劑HY-128686，觀察對腦組織IgG、MMP-9、IL-1β 以及IL-6 表達(dá)變化，研究HY-128686 對腦梗死神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 動物

成年雄性大鼠60 只，6～8 周齡，280～320 g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，在12 h 光照/黑暗周期下自由飲食飲水，溫度保持在18 ℃～26 ℃，濕度40%～70%，每籠2 只大鼠。所有動物程序均遵守大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過大學(xué)動物護(hù)理使用委員會以及倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 線栓法短暫性局灶性腦缺血大鼠模型

使用短暫性局灶性缺血的線栓法模型對大鼠進(jìn)行90 min 的短暫性腦中動脈閉塞（MCAO）。醫(yī)用級氧氣中添加2%～2.5%的異戊烷深度麻醉大鼠，手術(shù)過程中使用恒溫加熱臺（Global Industries，美國）維持37℃。頸中線切口后從迷走神經(jīng)中分離出頸總動脈（CCA），并用4-0 絲線縫合結(jié)扎（Holliston，美國）。臨時用微血管夾夾住頸外動脈和翼腭動脈，在結(jié)扎上方CCA 上進(jìn)行動脈切開術(shù)，通過頸內(nèi)動脈向上插入4-0 硅酮包覆線（Doccol Corporation，美國）進(jìn)入大腦中動脈直到檢測到輕微阻力。暫時關(guān)閉切口，讓大鼠在恒溫加熱室（Paso Robles，美國）中恢復(fù)約80 min 后進(jìn)行后續(xù)操作。

1.3 藥物處理

HY-128686 購自美國Cayman Chemical 公司，線栓法短暫性局灶性腦缺血大鼠模型建立后，使大鼠在恒溫加熱室（Paso Robles，美國）中恢復(fù)約80 min，動物隨機(jī)分組，每組10 只：使用不同劑量的HY-128686（0～1.2 mg/kg，溶于5 mL 生理鹽水中），尾靜脈注射處理大鼠；對照組大鼠靜脈注射等體積生理鹽水，每日注射1 次，持續(xù)處理21 d，處理結(jié)束后頸椎脫臼處死大鼠。

1.4 組織收集和裂解均質(zhì)

使用戊巴比妥（150 mg /kg；i.p）（碧云天試劑公司，中國）深度麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠，放入4℃的生理鹽水。使用腦模具（Zivic Instruments，美國）提取大鼠大腦，并切割為2 mm 切片。第4 切片對應(yīng)前囟，為該模型腦梗死核心區(qū)域，將其切成同側(cè)和對側(cè)皮層以及同側(cè)和對側(cè)下皮層后在干冰上冷凍用于ELISA 、RT-PCR 和免疫印跡檢測。剩余的切片用于計(jì)算梗死面積。

將組織稱重并用組織裂解器在放射免疫沉淀緩沖液中勻漿，每mg組織中添加10 μL 1%十二烷基硫酸鈉（SDS）、1%脫氧膽酸鈉（碧云天試劑公司，中國）；150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl（pH=7.6）和1%的IGEPAL RCA-630（百奧萊博試劑公司，中國）；裂解后每毫升裂解混合物添加10μL HALT 蛋白酶抑制劑混合物、HALT 磷酸酶抑制劑混合物和0.5 mol/L EDTA（Thermo Fisher，美國）。用Vibra-CellTM超聲儀（Sonics＆Materials，美國）處理樣品2 次，每次15 s，冰上孵育15 min后，4℃，14 000 r/min，離心20 min。吸取上清液于EP 管，-80℃下保存至使用。

1.5 梗死面積及體積檢測

將腦片1～3 和5～6 在2%的2，3，5-三苯基四唑氯化物磷酸鹽緩沖溶液（PBS，海派醫(yī)藥公司，中國）中室溫孵育30 min，然后置于4%多聚甲醛中染色，活組織染為紅色，死亡組織為白色。用HP Scanjet 8300（帕洛阿爾托公司，美國）掃描各切片，分辨率為600 dpi，除第3 片外均沿延髓側(cè)向下掃描切片。第3 切片沿尾側(cè)向下掃描，代表第4 切片延髓側(cè)。

使用Adobe Photoshop CS5（EG 公司，英國）將每個切片劃分紅色組織，腦梗死表面積（mm2）=對側(cè)紅色組織-同側(cè)紅色組織；總梗死體積=死組織總表面積（mm2）×切片厚度（2 mm）。

1.6 ELISA 試劑盒測定IgG 活性

按照制造商的說明，使用免疫球蛋白G（IgG）ELISA 試劑盒（圣克魯斯生物技術(shù)公司，美國）：每個反應(yīng)孔中加0.05 mL 抗體結(jié)合蛋白A/G（圣克魯斯生物技術(shù)公司，美國）包被96 孔板，4℃孵育過夜。每孔添加50 uL 切片勻漿液，37℃ 孵育0.5 h。棄液后洗滌3 次，每孔中加入相應(yīng)酶標(biāo)抗體100 μL，37℃ 孵育0.5 h 后洗滌，加入100 μL 四甲基聯(lián)苯胺（TMB，圣克魯斯生物技術(shù)公司，美國），室溫孵育30 min，加入50 μL 終止溶液。使用酶標(biāo)儀（艾森博奧公司，美國）測量450 nm 處吸光度。

1.7 免疫印跡檢測MMP-9 和緊密結(jié)合蛋白

使用5%β-巰基乙醇稀釋40 μg 總蛋白（1∶1 000），加熱變性10 min 后檢測緊密結(jié)合蛋白閉合蛋白；使用2%的β-巰基乙醇稀釋40 μg 總蛋白（1∶500）后檢測緊密結(jié)合蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）；使用5%β-巰基乙醇稀釋50 μg 總蛋白（1∶5 000），加熱變性10 min 后檢測MMP-9。

蛋白變性后上樣，0.1%SDS Tris-甘氨酸緩沖液中電泳通過Mini-PROTEAN TGX 凝膠電泳（15%，CST，美國），200 V，45 min；在10%甲醇的Tris-甘氨酸緩沖液中平衡10 min，25 V 下轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上（Billerica，美國）。室溫下在含5%脫脂牛奶的TBS 中封閉1 h，然后在含5%脫脂牛奶的TBST 中與一抗4℃孵育過夜。用TBST 洗滌PVDF 膜4 次，在含0.01%SDS，5%脫脂牛奶的TBST 中（格魯斯特，中國）與山羊抗兔IRDye 800 CW（1∶3 000，西格瑪奧德里奇公司，美國）室溫孵育1 h。TBST 洗滌去除多余抗體，與β-肌動蛋白一抗（1∶1 000，西格瑪奧德里奇公司，美國）室溫孵育2 h。TBST 洗滌4 次，在含0.01%SDS、5%脫脂牛奶的TBST 中與驢抗大鼠IRDye 680LT（1∶40 000，LiCor 公司，美國）室溫孵育1 h，然后用奧德賽紅外掃描系統(tǒng)（LiCor 公司，美國）進(jìn)行掃描。以肌動蛋白信號為內(nèi)參進(jìn)行蛋白表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8 qRT-PCR

將第4 個切片（該模型腦梗死核心區(qū)域）對應(yīng)組織切成同側(cè)和對側(cè)半球，并進(jìn)一步分為紋狀體和皮層部分，放入RNA 穩(wěn)定試劑（10 μL/mg 組織，Qigen，德國）。根據(jù)制造商的說明，采用TRIzol 法提取組織和細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法檢測RNA 濃度和純度。用iScriptTMReverse Transcription Supermix（Integrated DNA Technologies，美國）將1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用IDTE 緩沖液（pH=8.0，Integrated DNA Technologies，美國）稀釋至10 ng/μL。分別使用20 ng 同側(cè)和對側(cè)半球紋狀體和皮層組織部分cDNA 進(jìn)行qPCR，用IL-1β、IL-6、MMP-9 靶向探針（500 nmol/L，Integrated DNA Technologies，美國）進(jìn)行探測。依據(jù)qPCR 說明書進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃45 s；70℃ 45 s，共40 個循環(huán)。qPCR 引物見表1。相應(yīng) mRNA 表達(dá)量檢測以參考基因（Ywhaz）進(jìn)行歸一化處理。Ct 值以2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算，代表相應(yīng)mRNA 的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)引物序列

1.9 神經(jīng)系統(tǒng)缺陷評估

在誘導(dǎo)MCAO 前以及藥物注射后2、7、14、21 d，對大鼠進(jìn)行24 h 和48 h 的任務(wù)訓(xùn)練，并在48 h 時進(jìn)行測試。訓(xùn)練大鼠去除前側(cè)以及對側(cè)爪上的小貼紙，記錄去除小貼紙的潛伏期，試驗(yàn)重復(fù)3 次后取平均值進(jìn)行分析，以此評估大鼠長期感覺。訓(xùn)練大鼠使其停留在自動旋轉(zhuǎn)腳架上（4 r/min 加速到40 r/min），記錄大鼠跌倒?jié)摲冢囼?yàn)重復(fù)5 次后取平均值作為每只動物的基線值，以此評估精細(xì)運(yùn)動控制缺陷。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 6.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，分類變量以計(jì)數(shù)和百分比形式表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行分析；定量資料用±s表示，組間比較選用t檢驗(yàn)。P<0.05時差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梗死面積

與對照組相比，再灌注24 h 后，使用（0.2～1.2 mg/kg）HY-128686 治療后皮質(zhì)和皮質(zhì)下部分（P<0.05，圖1A、B）總梗死面積及體積（P<0.05，圖1C）顯著減少，提示1.0 mg/kg 的HY-128686 具有最好的療效，因此選擇此劑量處理的大鼠組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 使用EP4 質(zhì)激動劑 HY-128686 治療后梗死面積

2.2 IgG 水平

每組大鼠的第4 張切片（2 mm 厚）的腦組織用于IgG 的ELISA 分析。與對照組相比，使用1.0 mg/kg HY-128686 治療后，皮質(zhì)下和皮質(zhì)中IgG 含量顯著降低（P<0.05，圖2）。

圖2 用EP4 激動劑HY-128686 治療腦梗死大鼠模型后大腦中IgG 含量

2.3 MMP-9、IL6、IL-1β 以及ZO-1 表達(dá)變化

免疫印跡檢測表明，與對照組相比，使用1.0 mg/kg HY-128686 治療后皮質(zhì)中MMP-9 水平顯著降低（P<0.05，圖3），皮質(zhì)下同樣明顯降低（P>0.05，圖3）；qRT-PCR 分析顯示，與對照組相比，使用1.0 mg/kg HY-128686 治療后皮質(zhì)和皮質(zhì)下IL-1β和IL-6 mRNA 顯著降低（P<0.05，圖4）。與對照組相比，使用 HY-128686 處理的大鼠同側(cè)皮質(zhì)中ZO-1 表達(dá)升高（圖5）。

圖3 EP4 激動劑 HY-128686 治療后腦梗死大鼠模型中MMP-9 含量

圖4 HY-128686 處理后IL-1β、IL-6 mRNA 的表達(dá)

圖5 HY-128686 對ZO-1 蛋白的影響

2.4 對受損神經(jīng)功能的長期保護(hù)

再灌注開始時，與對照組相比，靜脈注射1.0 mg/kg HY-128686的大鼠在梗死后1、2和3周的貼紙去除實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)更好（P<0.05，P<0.01，圖6A），并且也停留在旋轉(zhuǎn)腳手架上的時間更長（P<0.05，圖6B），表明 HY-128686促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

圖6 HY-128686 治療腦梗死引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷評估

3 討論

目前研究顯示MMPs 在組織修復(fù)、血管生成、細(xì)胞遷移以及組織形態(tài)形成中扮演著重要角色，其中MMP-9 是 MMPs 家族一員，具有廣泛的底物特異性，可有效降解Ⅱ、Ⅳ和Ⅸ型膠原蛋白，導(dǎo)致斑塊破裂形成血栓，同時以蛋白水解方式分解內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜細(xì)胞之間神經(jīng)血管單元屏障功能所必需的緊密連接蛋白，改變血腦屏障（BBB）的通透性，使得腦實(shí)質(zhì)中出現(xiàn)包括IgG 蛋白，影響缺血性腦梗死的發(fā)病過程[17]。

血管神經(jīng)單元（neurovascular unit，NVU）包括神經(jīng)元和由其參與構(gòu)成的血腦屏障，發(fā)揮維持滲透性平衡的作用，使脈管系統(tǒng)進(jìn)行物質(zhì)交換[18]。血腦屏障由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞足突和基底膜組成，通過其特殊結(jié)構(gòu)能阻擋病原生物和其他大分子物質(zhì)由血循環(huán)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，減少腦組織受到血液循環(huán)中有害物質(zhì)的損害，從而維持腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡，發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)功能。細(xì)胞質(zhì)附著蛋白ZO-1、跨膜蛋白閉合蛋白和細(xì)胞骨架蛋白共同組成緊密連接，是血腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在維持血腦屏障結(jié)構(gòu)發(fā)揮中樞神經(jīng)穩(wěn)態(tài)的重要作用[19-20]。本研究結(jié)果顯示與對照組相比，使用HY-128686 處理的大鼠同側(cè)皮層中ZO-1 表達(dá)升高，這說明HY-128686 能夠有效改善腦組織滲透性及發(fā)揮治療血腦屏障的作用。

腦梗死發(fā)生后神經(jīng)血管細(xì)胞與外周免疫系統(tǒng)之間的細(xì)胞和分子之間的相互作用改變血腦屏障的通透性，引發(fā)炎癥反應(yīng)以及免疫細(xì)胞浸潤，同時ROS 直接破壞組成BBB 的內(nèi)皮細(xì)胞，并間接激活MMP，從而導(dǎo)致基底層蛋白和緊密連結(jié)蛋白水解降解，損害神經(jīng)血管單元[21]。而本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，使用1.0 mg/kg HY-128686 治療后皮層中MMP-9 水平顯著降低，皮質(zhì)下也明顯降低；而qRT-PCR 分析顯示，使用1.0 mg/kg HY-128686治療后皮質(zhì)和皮質(zhì)下IL-1β 和IL-6 mRNA 顯著降低，表明HY-128686 治療后能夠有效改善腦梗死引起的免疫反應(yīng)，減輕炎癥造成的腦損傷。

前列腺素類物質(zhì)包括前列腺素和血栓烷素，是20 碳不飽和脂肪酸的環(huán)氧產(chǎn)物。EP 分為4 種亞型，分別為 EP1、EP2、EP3 和 EP4[22-23]。EP4 受體廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和外周免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，為7 次跨膜激活型G 蛋白（Gs）-蛋白偶聯(lián)受體，激活后促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平升高進(jìn)而激活蛋白激酶A（PKA），磷酸iNOS 水平，從而增加局部NO 濃度誘導(dǎo)血管舒張從而改變腦血流量[24]。EP4 受體激動后能夠抑制核因子-κB（NF-κB）的激活減少其靶基因IL-1β 轉(zhuǎn)錄[25]。另一項(xiàng)研究表明，在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型中EP4 受體激動劑AE1-329 可顯著改善腦水腫以及減少炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)，從而保護(hù)腦損傷的發(fā)生[26-27]。同樣地這一現(xiàn)象在本研究中得到證實(shí)，本研究結(jié)果證明了HY-128686 能夠通過激活EP4 受體從而減少炎癥因子IL-1β 基因轉(zhuǎn)錄和MMP-3 和MMP-9 表達(dá)，同時抑制缺血性腦梗死誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子IL-1β 和IL-6 的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。通過以上結(jié)果驗(yàn)證了HY-128686 對腦梗死的治療作用，為未來的腦梗死治療提供了新的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。