C-反應(yīng)蛋白及其基因多態(tài)性與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的相關(guān)性研究

陸 麗，鐘 敏，徐海波，羅麗瓊，陳清梅，羅小雨

(廣東省深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)中心產(chǎn)科，廣東 深圳 518000)

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(Intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一種好發(fā)于妊娠中晚期特有的并發(fā)癥，臨床常見癥狀為皮膚瘙癢、黃疸，同時合并不同程度的血清膽汁酸升高和肝功能受損。數(shù)據(jù)[1]顯示，ICP具有明顯的種族性和地域性，我國以長江流域部分地區(qū)的發(fā)病率較高。ICP的大部分孕產(chǎn)婦可于產(chǎn)后很快恢復(fù)，但其對胎兒及新生兒的影響較大，可能造成新生兒窒息、新生兒顱內(nèi)出血、胎死宮內(nèi)等不良結(jié)局，嚴(yán)重危害胎兒的生命安全。近幾年，越來越多學(xué)者傾向于探究炎性因子在ICP中的表達(dá)水平及臨床意義，但是其相關(guān)基礎(chǔ)研究較少。蔣長斌等人研究[2]發(fā)現(xiàn)，ICP中腫瘤壞死因子-α(tumorn ecrosis factoro，TNF-α)、高敏C-反應(yīng)蛋白(high sensitive C-reactive protein，hs-CRP)等相關(guān)指標(biāo)水平明顯升高，同時以上指標(biāo)可用于評估ICP嚴(yán)重程度及不良結(jié)局。據(jù)報道[3]，白介素-6(intefleuldn，IL-6)、TNF-α在ICP中表達(dá)水平異常，多種炎性因子相互作用，可能參與ICP的病理生理過程。目前，臨床上缺乏關(guān)于C-反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)及其基因多態(tài)性與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥疾病的相關(guān)性報道。筆者以此為切入點(diǎn)，旨在為臨床提供ICP診療的新思路，同時為其發(fā)病機(jī)制提供理論參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料：本研究經(jīng)院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象選取我院 2019年12月～2020年11月納入我科住院的ICP孕婦50例為觀察組，根據(jù)血清總膽汁酸水平將觀察組孕婦分為ICP輕度組25例和ICP重度組25例，同期選擇住院的正常孕婦50例為對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：①均符合《九版婦產(chǎn)科學(xué)》有關(guān)ICP的相關(guān)診斷；②無皮膚病、尿毒癥性瘙癢、妊娠特異性皮炎、過敏性反應(yīng)等疾病者；③無病毒性肝炎、肝膽石癥、急性脂肪肝、子癇前期等疾病者；④知情并簽署知情同意書。觀察組年齡為20～43歲，平均(31.86±4.63)歲，孕周為34～41周，平均(34.82±4.11)周，BMI 35～37 kg/m2，平均(35.86±0.53)kg/m2；對照組年齡為20～42歲，平均(32.51±4.87)歲，孕周為35～42周，平均(35.21±4.34)周，BMI 36～37 kg/m2，平均(36.86±0.45)kg/m2，兩組患者在年齡、孕周、BMI等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法：抽取所有產(chǎn)婦空腹外周肘靜脈血5 ml，置入一次性抗凝真空采血管(K2- EDTA)中，靜置于常溫空氣中30.0 min，隨后放入3 000 r/min離心機(jī)中，高速離心15 min，放置于-20℃冰箱中保存待測。本院檢驗(yàn)科專業(yè)醫(yī)生使用免疫透射比濁法測定CRP水平以及使用酶聯(lián)免疫吸附法測定TNF-α、IL-6水平。

在公開的數(shù)據(jù)庫中查詢CRP基因SNP信息，測定CRP基因啟動子區(qū)- 757T/C(rs3093059)，-409G/A(rs3093062)、-717A/G (rs2794521)、內(nèi)含子區(qū)的+29A/T(rs1417938)四個位點(diǎn)的基因多態(tài)性。多態(tài)性包括rs3093059位點(diǎn)：CC、CT、TT型；rs3093062位點(diǎn)：AA型、AG型、GG型；rs2794521位點(diǎn)：AA型、AG型、GG型、rs1417938位點(diǎn)：AA、A/T、TT型。將待測標(biāo)本恢復(fù)至室溫，采用全血基因DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟操作。采用核酸蛋白測定儀測定DNA的OD值，確定DNA濃度，最后-20°冰箱中備存待測。從外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell ，PBMC)中提取總RNA，采用real-time PCR及TaqMan技術(shù)對相關(guān)SNP進(jìn)行基因型鑒定。使用TaqMan HT7900實(shí)時焚光定量 PCR 儀 (美國加州Applied Biosystems公司 )進(jìn)行 real-time PCR 。10 μl反應(yīng)體系(Master Mix 5 μl，正反 向引物各0.2 μl，cDNAl μl，水3.6 μl)在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下進(jìn)行。

1.3判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)血清總膽汁酸水平將觀察組孕婦分為ICP輕度組和ICP重度組，即ICP輕度：①血清總膽汁酸為10～39.9 μmol/L；②主要癥狀為瘙癢，無其他明顯癥狀。ICP重度：①血清總膽汁酸≥40 μmol/L；②復(fù)發(fā)性ICP，癥狀嚴(yán)重且合并多胎妊娠、妊娠期高血壓病等其他疾病，既往存在因ICP所致死胎史或新生兒窒息死亡史等病史，滿足以上任何一條即為重度。

1.4觀察指標(biāo)：①比較觀察組和對照組間血清CRP、TNF-α、IL-6水平差異；②比較對照組和觀察組四個位點(diǎn)基因型頻率的差異；③比較ICP輕度組和重度組間四個位點(diǎn)基因型頻率的差異。

2 結(jié)果

2.1觀察組和對照組間血清CRP、TNF-α、IL-6水平差異比較：觀察組孕婦的CRP、TNF-α、IL-6水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 觀察組和對照組間血清CRP、TNF-α、IL-6水平差異比較

2.2觀察組和對照組四個位點(diǎn)基因型頻率的差異比較：觀察組rs3093059、rs1417938位點(diǎn)基因型頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，rs3093062、 rs2794521位點(diǎn)基因型頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 觀察組和對照組四個位點(diǎn)基因型頻率的差異比較[例(%)]

2.3ICP輕度組和重度組間四個位點(diǎn)基因型頻率的差異比較：ICP輕度組和重度組間四個位點(diǎn)基因型頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 ICP輕度組和重度組間四個位點(diǎn)基因型頻率的差異比較[例(%)]

3 討論

ICP是產(chǎn)科常見妊娠中晚期疾病，對胎兒危害性極大。研究發(fā)現(xiàn)，ICP會增加胎兒或新生兒發(fā)生不良結(jié)局的風(fēng)險，如早產(chǎn)、死胎、新生兒窒息等不良結(jié)局，同時嚴(yán)重影響孕產(chǎn)婦的生活質(zhì)量[5]。目前，有關(guān)ICP的病因和發(fā)病機(jī)制仍未明確，普遍認(rèn)為與機(jī)體免疫因素、遺傳、環(huán)境等多因素共同相互作用所致。然而，本研究認(rèn)為ICP與免疫因素密切相關(guān)，其發(fā)生可能與孕婦妊娠期間機(jī)體免疫平衡失調(diào)有關(guān)。ICP常發(fā)生于妊娠中晚期，考慮妊娠后期胎盤分泌大量雌激素、孕激素、甲狀腺激素等阻礙肝細(xì)胞進(jìn)行正常代謝，從而引起肝內(nèi)膽汁淤積。研究發(fā)現(xiàn)，既往存在母親或姐妹曾患ICP家族史的孕婦患ICP的風(fēng)險可能會相應(yīng)的增加[6]，符合孟德爾顯性遺傳規(guī)律，表明遺傳、環(huán)境因素在ICP疾病發(fā)生發(fā)展過程中充當(dāng)必要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)生環(huán)節(jié)中以炎性反應(yīng)最為關(guān)鍵，其中CRP在機(jī)體免疫炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[7]。ICP機(jī)體免疫失衡時，其CRP等相關(guān)炎性因子水平升高，提示機(jī)體合并感染與肝細(xì)胞損傷。正常妊娠胎盤組織中可檢測TNF-α表達(dá)，其表達(dá)水平隨妊娠結(jié)束逐漸恢復(fù)正常。IL-6主要是由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞共同作用產(chǎn)生，通過刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-8、TNF-α等炎性因子，增加NK細(xì)胞毒性作用，造成肝臟微循環(huán)發(fā)生障礙，使得肝細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞受損[8]。多項(xiàng)研究證實(shí)，CRP、TNF-α、IL-6等炎性因子在ICP中呈異常表達(dá)水平，可能共同參與ICP疾病發(fā)生發(fā)展[9-10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組孕婦的CRP、TNF-α、IL-6水平明顯高于對照組，加以證實(shí)以上炎性因子與ICP密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，CRP及其基因多態(tài)性與多種疾病呈相關(guān)性，如急性心肌梗死、出血性腦卒中等疾病，但其CRP基因單核苷酸多態(tài)性信息不同[11-12]。根據(jù)公開數(shù)據(jù)庫中查詢CRP基因單核苷酸多態(tài)性信息，發(fā)現(xiàn)CRP基因啟動子區(qū)- 757T/C(rs3093059)，-409G/A(rs3093062)、-717A/G(rs2794521)、+29A/T(rs1417938)與CRP水平密切相關(guān)。CRP的表達(dá)水平受CRP基因多態(tài)性影響，其中757T/C (rs3093059)雙C/C轉(zhuǎn)錄起始水平和CRP水平呈明顯相關(guān)，+29A/T (rs1417938)與機(jī)體CRP水平、炎性反應(yīng)程度呈明顯相關(guān)[13-14]。ICP機(jī)體通過產(chǎn)生大量的IL-6、CRP等炎性細(xì)胞因子，加之自身肝細(xì)胞已受損，進(jìn)一步激發(fā)免疫炎性反應(yīng)，使得膽汁酸、毒素、炎性因子大量蓄積于肝臟，加重肝細(xì)胞受損程度[15]。本研究結(jié)果顯示，觀察組rs3093059、rs1417938位點(diǎn)基因型頻率明顯高于對照組，其中rs3093059位點(diǎn)CC基因型、rs1417938位點(diǎn)A/T基因型頻率明顯高于對照組，提示以上兩種位點(diǎn)的基因型可能與ICP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。CRP基因多態(tài)性與ICP的嚴(yán)重程度未見明顯差異性，考慮與樣本量過小有關(guān)，有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，CRP、TNF-α、IL-6表達(dá)水平在ICP中呈升高趨勢，其中rs3093059位點(diǎn)CC基因型、rs1417938位點(diǎn)A/T基因型可能與ICP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，有望成為ICP診療的新靶標(biāo)。