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      C-反應(yīng)蛋白及其基因多態(tài)性與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的相關(guān)性研究

      2021-09-17 07:50:42徐海波羅麗瓊陳清梅羅小雨
      吉林醫(yī)學(xué) 2021年9期
      關(guān)鍵詞:多態(tài)性基因型炎性

      陸 麗,鐘 敏,徐海波,羅麗瓊,陳清梅,羅小雨

      (廣東省深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)中心產(chǎn)科,廣東 深圳 518000)

      妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是一種好發(fā)于妊娠中晚期特有的并發(fā)癥,臨床常見癥狀為皮膚瘙癢、黃疸,同時合并不同程度的血清膽汁酸升高和肝功能受損。數(shù)據(jù)[1]顯示,ICP具有明顯的種族性和地域性,我國以長江流域部分地區(qū)的發(fā)病率較高。ICP的大部分孕產(chǎn)婦可于產(chǎn)后很快恢復(fù),但其對胎兒及新生兒的影響較大,可能造成新生兒窒息、新生兒顱內(nèi)出血、胎死宮內(nèi)等不良結(jié)局,嚴(yán)重危害胎兒的生命安全。近幾年,越來越多學(xué)者傾向于探究炎性因子在ICP中的表達(dá)水平及臨床意義,但是其相關(guān)基礎(chǔ)研究較少。蔣長斌等人研究[2]發(fā)現(xiàn),ICP中腫瘤壞死因子-α(tumorn ecrosis factoro,TNF-α)、高敏C-反應(yīng)蛋白(high sensitive C-reactive protein,hs-CRP)等相關(guān)指標(biāo)水平明顯升高,同時以上指標(biāo)可用于評估ICP嚴(yán)重程度及不良結(jié)局。據(jù)報道[3],白介素-6(intefleuldn,IL-6)、TNF-α在ICP中表達(dá)水平異常,多種炎性因子相互作用,可能參與ICP的病理生理過程。目前,臨床上缺乏關(guān)于C-反應(yīng)蛋白(C-reaction protein,CRP)及其基因多態(tài)性與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥疾病的相關(guān)性報道。筆者以此為切入點(diǎn),旨在為臨床提供ICP診療的新思路,同時為其發(fā)病機(jī)制提供理論參考依據(jù)。

      1 資料與方法

      1.1一般資料:本研究經(jīng)院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),研究對象選取我院 2019年12月~2020年11月納入我科住院的ICP孕婦50例為觀察組,根據(jù)血清總膽汁酸水平將觀察組孕婦分為ICP輕度組25例和ICP重度組25例,同期選擇住院的正常孕婦50例為對照組,納入標(biāo)準(zhǔn)[4]:①均符合《九版婦產(chǎn)科學(xué)》有關(guān)ICP的相關(guān)診斷;②無皮膚病、尿毒癥性瘙癢、妊娠特異性皮炎、過敏性反應(yīng)等疾病者;③無病毒性肝炎、肝膽石癥、急性脂肪肝、子癇前期等疾病者;④知情并簽署知情同意書。觀察組年齡為20~43歲,平均(31.86±4.63)歲,孕周為34~41周,平均(34.82±4.11)周,BMI 35~37 kg/m2,平均(35.86±0.53)kg/m2;對照組年齡為20~42歲,平均(32.51±4.87)歲,孕周為35~42周,平均(35.21±4.34)周,BMI 36~37 kg/m2,平均(36.86±0.45)kg/m2,兩組患者在年齡、孕周、BMI等一般資料比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

      1.2方法:抽取所有產(chǎn)婦空腹外周肘靜脈血5 ml,置入一次性抗凝真空采血管(K2- EDTA)中,靜置于常溫空氣中30.0 min,隨后放入3 000 r/min離心機(jī)中,高速離心15 min,放置于-20℃冰箱中保存待測。本院檢驗(yàn)科專業(yè)醫(yī)生使用免疫透射比濁法測定CRP水平以及使用酶聯(lián)免疫吸附法測定TNF-α、IL-6水平。

      在公開的數(shù)據(jù)庫中查詢CRP基因SNP信息,測定CRP基因啟動子區(qū)- 757T/C(rs3093059),-409G/A(rs3093062)、-717A/G (rs2794521)、內(nèi)含子區(qū)的+29A/T(rs1417938)四個位點(diǎn)的基因多態(tài)性。多態(tài)性包括rs3093059位點(diǎn):CC、CT、TT型;rs3093062位點(diǎn):AA型、AG型、GG型;rs2794521位點(diǎn):AA型、AG型、GG型、rs1417938位點(diǎn):AA、A/T、TT型。將待測標(biāo)本恢復(fù)至室溫,采用全血基因DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟操作。采用核酸蛋白測定儀測定DNA的OD值,確定DNA濃度,最后-20°冰箱中備存待測。從外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell ,PBMC)中提取總RNA,采用real-time PCR及TaqMan技術(shù)對相關(guān)SNP進(jìn)行基因型鑒定。使用TaqMan HT7900實(shí)時焚光定量 PCR 儀 (美國加州Applied Biosystems公司 )進(jìn)行 real-time PCR 。10 μl反應(yīng)體系(Master Mix 5 μl,正反 向引物各0.2 μl,cDNAl μl,水3.6 μl)在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下進(jìn)行。

      1.3判定標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)血清總膽汁酸水平將觀察組孕婦分為ICP輕度組和ICP重度組,即ICP輕度:①血清總膽汁酸為10~39.9 μmol/L;②主要癥狀為瘙癢,無其他明顯癥狀。ICP重度:①血清總膽汁酸≥40 μmol/L;②復(fù)發(fā)性ICP,癥狀嚴(yán)重且合并多胎妊娠、妊娠期高血壓病等其他疾病,既往存在因ICP所致死胎史或新生兒窒息死亡史等病史,滿足以上任何一條即為重度。

      1.4觀察指標(biāo):①比較觀察組和對照組間血清CRP、TNF-α、IL-6水平差異;②比較對照組和觀察組四個位點(diǎn)基因型頻率的差異;③比較ICP輕度組和重度組間四個位點(diǎn)基因型頻率的差異。

      2 結(jié)果

      2.1觀察組和對照組間血清CRP、TNF-α、IL-6水平差異比較:觀察組孕婦的CRP、TNF-α、IL-6水平明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

      表1 觀察組和對照組間血清CRP、TNF-α、IL-6水平差異比較

      2.2觀察組和對照組四個位點(diǎn)基因型頻率的差異比較:觀察組rs3093059、rs1417938位點(diǎn)基因型頻率明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),rs3093062、 rs2794521位點(diǎn)基因型頻率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

      表2 觀察組和對照組四個位點(diǎn)基因型頻率的差異比較[例(%)]

      2.3ICP輕度組和重度組間四個位點(diǎn)基因型頻率的差異比較:ICP輕度組和重度組間四個位點(diǎn)基因型頻率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

      表3 ICP輕度組和重度組間四個位點(diǎn)基因型頻率的差異比較[例(%)]

      3 討論

      ICP是產(chǎn)科常見妊娠中晚期疾病,對胎兒危害性極大。研究發(fā)現(xiàn),ICP會增加胎兒或新生兒發(fā)生不良結(jié)局的風(fēng)險,如早產(chǎn)、死胎、新生兒窒息等不良結(jié)局,同時嚴(yán)重影響孕產(chǎn)婦的生活質(zhì)量[5]。目前,有關(guān)ICP的病因和發(fā)病機(jī)制仍未明確,普遍認(rèn)為與機(jī)體免疫因素、遺傳、環(huán)境等多因素共同相互作用所致。然而,本研究認(rèn)為ICP與免疫因素密切相關(guān),其發(fā)生可能與孕婦妊娠期間機(jī)體免疫平衡失調(diào)有關(guān)。ICP常發(fā)生于妊娠中晚期,考慮妊娠后期胎盤分泌大量雌激素、孕激素、甲狀腺激素等阻礙肝細(xì)胞進(jìn)行正常代謝,從而引起肝內(nèi)膽汁淤積。研究發(fā)現(xiàn),既往存在母親或姐妹曾患ICP家族史的孕婦患ICP的風(fēng)險可能會相應(yīng)的增加[6],符合孟德爾顯性遺傳規(guī)律,表明遺傳、環(huán)境因素在ICP疾病發(fā)生發(fā)展過程中充當(dāng)必要的作用。

      研究發(fā)現(xiàn),肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)生環(huán)節(jié)中以炎性反應(yīng)最為關(guān)鍵,其中CRP在機(jī)體免疫炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[7]。ICP機(jī)體免疫失衡時,其CRP等相關(guān)炎性因子水平升高,提示機(jī)體合并感染與肝細(xì)胞損傷。正常妊娠胎盤組織中可檢測TNF-α表達(dá),其表達(dá)水平隨妊娠結(jié)束逐漸恢復(fù)正常。IL-6主要是由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞共同作用產(chǎn)生,通過刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-8、TNF-α等炎性因子,增加NK細(xì)胞毒性作用,造成肝臟微循環(huán)發(fā)生障礙,使得肝細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧,最終導(dǎo)致肝細(xì)胞受損[8]。多項(xiàng)研究證實(shí),CRP、TNF-α、IL-6等炎性因子在ICP中呈異常表達(dá)水平,可能共同參與ICP疾病發(fā)生發(fā)展[9-10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),觀察組孕婦的CRP、TNF-α、IL-6水平明顯高于對照組,加以證實(shí)以上炎性因子與ICP密切相關(guān)。

      研究發(fā)現(xiàn),CRP及其基因多態(tài)性與多種疾病呈相關(guān)性,如急性心肌梗死、出血性腦卒中等疾病,但其CRP基因單核苷酸多態(tài)性信息不同[11-12]。根據(jù)公開數(shù)據(jù)庫中查詢CRP基因單核苷酸多態(tài)性信息,發(fā)現(xiàn)CRP基因啟動子區(qū)- 757T/C(rs3093059),-409G/A(rs3093062)、-717A/G(rs2794521)、+29A/T(rs1417938)與CRP水平密切相關(guān)。CRP的表達(dá)水平受CRP基因多態(tài)性影響,其中757T/C (rs3093059)雙C/C轉(zhuǎn)錄起始水平和CRP水平呈明顯相關(guān),+29A/T (rs1417938)與機(jī)體CRP水平、炎性反應(yīng)程度呈明顯相關(guān)[13-14]。ICP機(jī)體通過產(chǎn)生大量的IL-6、CRP等炎性細(xì)胞因子,加之自身肝細(xì)胞已受損,進(jìn)一步激發(fā)免疫炎性反應(yīng),使得膽汁酸、毒素、炎性因子大量蓄積于肝臟,加重肝細(xì)胞受損程度[15]。本研究結(jié)果顯示,觀察組rs3093059、rs1417938位點(diǎn)基因型頻率明顯高于對照組,其中rs3093059位點(diǎn)CC基因型、rs1417938位點(diǎn)A/T基因型頻率明顯高于對照組,提示以上兩種位點(diǎn)的基因型可能與ICP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。CRP基因多態(tài)性與ICP的嚴(yán)重程度未見明顯差異性,考慮與樣本量過小有關(guān),有待進(jìn)一步探索。

      綜上所述,CRP、TNF-α、IL-6表達(dá)水平在ICP中呈升高趨勢,其中rs3093059位點(diǎn)CC基因型、rs1417938位點(diǎn)A/T基因型可能與ICP的發(fā)生發(fā)展有關(guān),有望成為ICP診療的新靶標(biāo)。

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