VPS33B對卵巢癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制研究

曠思思，石麗云，廖秀瓊

(深圳市人民醫(yī)院計(jì)劃生育科，廣東 深圳 518028)

卵巢癌是目前臨床上較為常見的一種女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病早期具有極強(qiáng)的隱匿性，絕大多數(shù)患者一經(jīng)確診便已是中晚期，喪失了手術(shù)根治的時機(jī)，預(yù)后不良[1-2]。故此，探索卵巢的早期診斷新手段以及有效的新療法具有極其重要的意義，亦是提高卵巢癌患者生存周期的重中之重。VPS33B基因英文官方名稱為Vacuolar protein sorting 33 homologB(yeast)，該基因主要編碼蛋白空泡蛋白分選蛋白33B，上述蛋白是Secl/Munc-18(SM)蛋白家族成員之一[3]，既往臨床上關(guān)于VPS33B基因的報(bào)道主要集中在關(guān)節(jié)攣縮以及腎功能不全等方面，尚無關(guān)于該基因在腫瘤發(fā)病機(jī)制方面的研究報(bào)道。隨著近年來相關(guān)研究的日益深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)VPS33B基因在肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá)，可能是潛在的癌癥相關(guān)基因之一，有望成為卵巢癌治療的潛在靶點(diǎn)[4-5]。鑒于此，本文通過研究VPS33B對卵巢癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制，旨在為卵巢癌的診治提供新的思路和靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對象與方法

1.1材料：人卵巢癌OVACA-3細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基以及胎牛血清均購自美國Hyclone公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自天根生化科技有限公司；蛋白裂解液RIPA以及蛋白酶抑制劑PMSF均購自碧云天公司；PI3K、AKT、c-Myc單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology；VPS33B多克隆抗體購自Proteintech公司；TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；穩(wěn)定過度表達(dá)的VPS33B慢病毒購自銳博公司；特異性針對VPS33B的RNA干擾片段購自廣州銳博公司。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2研究方法

1.2.1構(gòu)建過表達(dá)VPS33B的OVACA-3細(xì)胞株：采用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2條件下實(shí)施傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時實(shí)施慢病毒轉(zhuǎn)染。取OVACA-3細(xì)胞以D-hanks洗滌3次，加入胰酶消化1～2 min，取適量培養(yǎng)基種植消化，800 r/min離心處理2 min后去除上清液，加入全培吹散細(xì)胞至單細(xì)胞懸液。取5 000個細(xì)胞置入24孔板內(nèi)，加入500μl全培，混勻，8 h后細(xì)胞貼壁后，計(jì)算各試劑所需劑量，進(jìn)行過度表達(dá)VPS33B的慢病毒轉(zhuǎn)染，6～8 h后換液，持續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2干擾VPS33B過表達(dá)組卵巢癌OVACA-3細(xì)胞株轉(zhuǎn)染siRNA靶向干擾VPS33B過表達(dá)處理：嚴(yán)格遵循siRNA轉(zhuǎn)染試劑說明書相關(guān)操作步驟，將干擾片段si-VPS33B離心后用150μl DEPC水溶解配置成終濃度為20 μmol/L的工作液，放置在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取生長至90%～95%的融合度的OVACA-3細(xì)胞，采用D-hanks洗滌3次，加入胰酶消化2 min，取適量培養(yǎng)基種植消化，800 r/min離心處理2 min后去除上清液，加入全陪吹散細(xì)胞至單細(xì)胞懸液。于6孔板內(nèi)各孔分別接種2×105個細(xì)胞，接種8～12 h后，待細(xì)胞貼壁，且密度達(dá)至40%～60%匯合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3細(xì)胞增殖測定：主要是通過四甲基偶氮唑(MTT)法進(jìn)行測定，具體操作如下：首先取處于對數(shù)生長期的OVACA-3細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細(xì)胞貼壁后無血清培養(yǎng)24 h。分別測定過表達(dá)VPS33B、轉(zhuǎn)染siRNA靶向干擾VPS33B過表達(dá)以及未經(jīng)處理的OVACA-3細(xì)胞，測定570 nm吸光度值。每次各組均設(shè)置5個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以平均值作為最終結(jié)果。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測：通過Annexin V-FITC流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種在直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，貼壁后在無血清狀態(tài)下培養(yǎng)，一應(yīng)操作嚴(yán)格參照細(xì)胞凋亡測定試劑盒說明書完成，每組重復(fù)3次，以平均值作為最終結(jié)果。

1.2.5PI3K、AKT、c-Myc蛋白濃度檢測：采用Westernblot法實(shí)現(xiàn)，首先在6孔板中加入100 μg的胰蛋白酶提取液，同時加入2 ml的培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞置入EP管內(nèi)，并與胰蛋白提取液根據(jù)1∶100比例混合，冷凍10 min，促使細(xì)胞完全裂變?yōu)镋溶液。于EP管內(nèi)以1∶100比例加入胰蛋白酶提取液2 ml，促使細(xì)胞完全裂變?yōu)镕溶液。將E與F溶液按照80∶1的體積混勻，放置在37.5℃保溫相中20 min，冷卻后計(jì)算PI3K、AKT、c-Myc蛋白濃度。

1.3觀察指標(biāo)：對比三組OVACA-3細(xì)胞增殖情況，三組OVACA-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后凋亡情況以及三組OVACA-3細(xì)胞PI3K、AKT、c-Myc蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1三組OVACA-3細(xì)胞增殖情況評價：過表達(dá)VPS33B組OVACA-3細(xì)胞增殖能力低于OVACA-3對照組和干擾VPS33B過表達(dá)組，且干擾VPS33B過表達(dá)組OVACA-3細(xì)胞增殖能力高于OVACA-3對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 三組OVACA-3細(xì)胞增殖情況評價

2.2三組OVACA-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后凋亡情況評價：過表達(dá)VPS33B組OVACA-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后活細(xì)胞占比低于OVACA-3對照組和干擾VPS33B過表達(dá)組，凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞占比高于OVACA-3對照組和干擾VPS33B過表達(dá)組；且干擾VPS33B過表達(dá)組OVACA-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后活細(xì)胞占比高于OVACA-3對照組，凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞占比低于OVACA-3對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 三組OVACA-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后凋亡情況評價

2.3三組OVACA-3細(xì)胞PI3K、AKT、c-Myc蛋白表達(dá)水平評價：過表達(dá)VPS33B組PI3K、AKT、c-Myc蛋白表達(dá)明顯低于OVACA-3對照組以及干擾VPS33B過表達(dá)組，且干擾VPS33B過表達(dá)組PI3K、AKT、c-Myc蛋白表達(dá)均高于OVACA-3對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖1～3。

圖1 三組細(xì)胞中PI3K蛋白表達(dá)水平變化，依次為干擾VPS33B過表達(dá)組、OVACA-3對照組、過表達(dá)VPS33B組

圖2 三組細(xì)胞中AKT蛋白表達(dá)水平變化，依次為干擾VPS33B過表達(dá)組、OVACA-3對照組、過表達(dá)VPS33B組

圖3 三組細(xì)胞中c-Myc蛋白表達(dá)水平變化，依次為干擾VPS33B過表達(dá)組、OVACA-3對照組、過表達(dá)VPS33B組

3 討論

迄今為止，關(guān)于卵巢癌的具體病因以及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與環(huán)境、內(nèi)分泌激素、遺傳、晚婚晚育等因素密切相關(guān)[6-8]。由于卵巢癌患者發(fā)病早期往往缺乏特異性癥狀，發(fā)現(xiàn)時往往已處于晚期階段，易出現(xiàn)腫瘤灶的轉(zhuǎn)移，臨床治療主要以手術(shù)聯(lián)合化療等綜合療法為主，但效果并不十分理想，嚴(yán)重威脅女性生命健康安全[9-10]。因此，探尋與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因，可為卵巢癌發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步為臨床診治方案的制定提供參考依據(jù)。相關(guān)研究報(bào)道顯示，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，多種基因均會發(fā)生異常改變，且長期處于該狀態(tài)下會影響細(xì)胞生長以及分化，從而為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展創(chuàng)造有利條件[11-13]。VPS33B基因主要定位于人15號染色體q26.1上，其所編碼的蛋白在蛋白排序功能調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[14]。由此可見，該基因表達(dá)可能與細(xì)胞增殖、凋亡存在密切相關(guān)，其具體作用機(jī)制值得臨床深入研究，可能為卵巢癌的治療提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VPS33B對卵巢癌細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，同時對卵巢癌細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。這提示了VPS33B基因可能在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著抑癌基因的角色?？紤]原因可能在于過表達(dá)VPS33B基因有效阻滯了細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促使細(xì)胞周期G1期朝S期轉(zhuǎn)化出現(xiàn)障礙，繼而導(dǎo)致細(xì)胞周期被阻滯在G1期，最終影響細(xì)胞增殖、分化。同時，VPS33B可能與NESG1在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著協(xié)同抑癌的作用，可能是通過調(diào)控可特異性結(jié)合DNA區(qū)域并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的蛋白分子表達(dá)，繼而干擾該類基因和相互作用的轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后翻譯。近年來，PI3K/AKT/c-Myc信號通路是眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)，其可在多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞的增殖以及分化。且有相關(guān)研究報(bào)道[15-17]證實(shí)，PI3K/AKT/c-Myc信號通路的活化可促進(jìn)淋巴血管的形成以及腫瘤細(xì)胞增殖，繼而促使病情朝不可控方向發(fā)展。作為機(jī)體內(nèi)的重要信號通路，PI3K活性增強(qiáng)可調(diào)控下游抗氧化蛋白，繼而促使機(jī)體受活性氧的損害，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞的氧化以及抗氧化平衡被打破，最終刺激了卵巢癌細(xì)胞的增殖[18-20]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)VPS33B組PI3K、AKT、c-Myc蛋白相對表達(dá)量明顯低于OVACA-3對照組以及干擾VPS33B過表達(dá)組，且干擾VPS33B過表達(dá)組PI3K、AKT、c-Myc蛋白相對表達(dá)量均高于OVACA-3對照組。這也提示了VPS33B對卵巢癌細(xì)胞增殖凋亡的影響機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/c-Myc信號通路活化有關(guān)，值得后續(xù)進(jìn)一步關(guān)注。

綜上所述，VPS33B可發(fā)揮明顯的抑制卵巢癌細(xì)胞增殖作用，同時對卵巢癌細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，其可能作用機(jī)制是抑制PI3K/AKT/c-Myc信號通路活性，值得進(jìn)一步研究。