木犀草素聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)裸鼠肝癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及機(jī)制研究

戴盈英

(蘇州市第九人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 蘇州 215000)

0 引言

肝癌是一種常見的，致死率極高的惡性腫瘤，致死率在惡性腫瘤中排名第四[1]。隨著環(huán)境污染和病毒感染(乙型肝炎和丙型肝炎)的不斷盛行，肝癌的發(fā)病率持續(xù)居高不下，已成為危害全球人類健康的重要公共健康問題[2]。手術(shù)切除、肝移植、射頻消融術(shù)和化療藥物(索拉非尼)是目前治療肝癌的只要措施[3]。然而，診斷不及時(shí)、肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)及藥物的副作用和耐藥性等問題，嚴(yán)重影響了目前的臨床治療效果[4,5]。研究表明，肝癌的中位生存率僅1年左右[6]。因此，尋找安全有效的抗肝癌藥物及治療方案迫在眉睫。

天然產(chǎn)物因其結(jié)構(gòu)新穎、安全、含量豐富，成為尋找抗腫瘤藥物的重要資源。木犀草素(Luteolin，Lut)和白藜蘆醇(Resveratrol，Res)為廣泛存在于水果和蔬菜中且被認(rèn)為基本無毒的天然產(chǎn)物，除了具有廣泛的抗炎、抗氧化作用外，也是公認(rèn)的抗癌天然產(chǎn)物[7,8]。木犀草素可誘導(dǎo)人肺癌、結(jié)腸癌和肝癌細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)細(xì)胞老化和凋亡[9]。白藜蘆醇則可有效抑制乳腺癌、食管癌和肝癌的生長(zhǎng)、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[10]。但因其生物利用度低，療效欠佳，單獨(dú)大劑量使用，亦可能產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。期研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素和白藜蘆醇聯(lián)用可通過協(xié)同抑制NF-κB的激活，發(fā)揮高效抗肝癌細(xì)胞(HepG2)生長(zhǎng)的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討木犀草素和白藜蘆醇聯(lián)用的體內(nèi)抗肝癌活性及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 BALB/c裸鼠、細(xì)胞及試劑

SPF級(jí) BALB/c裸鼠 (4-6周齡；18-22 g)共計(jì) 15只，均購自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，置恒溫(25±2)℃、恒濕、無菌獨(dú)立通風(fēng)籠中飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始試驗(yàn)；人肝癌細(xì)胞株(HepG2)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基(含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素)中，并置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中維持生長(zhǎng)；木犀草素、白藜蘆醇、索拉非尼均購自美國(guó)Sigma公司；FBS、DMEM高糖培養(yǎng)基和100×青霉素/鏈霉素均美國(guó)Hyclone公 司；GAPDH、NF-κB、p-NF-κB、Bcl-2、Bcl-2、Bax、和Caspase-3抗體均購自英國(guó)abcam公司；ECL顯色試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和通用RT-PCR試劑盒均購自上海Beyotime公司。本研究方案獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 肝癌荷瘤裸鼠模型建立及藥物干預(yù)

胰酶消化HepG2細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)，每只BALB/c裸鼠腋下注射100 μl細(xì)胞懸液(約含1×106個(gè)HepG2細(xì)胞)。待腫瘤體積生長(zhǎng)至50 mm3左右時(shí)，動(dòng)物被隨機(jī)分成5組，每組3只裸鼠，分別為：溶劑對(duì)照組(Vehicle)，動(dòng)物每天灌胃相同體積的生理鹽水；木犀草素組(50 mg/kg)，動(dòng)物每天灌胃給予50 mg/kg的木犀草素水溶液；白藜蘆醇組(100 mg/kg)，動(dòng)物每天灌胃給予100 mg/kg的白藜蘆醇水溶液；聯(lián)合用藥組(Lut50 mg/kg + Res100 mg/kg)，動(dòng)物每天灌胃給予50 mg/kg木犀草素和100 mg/kg白藜蘆醇的混合水溶液；陽性藥組(Sorafenib，30 mg/kg)，動(dòng)物每天灌胃給予30 mg/kg的索拉菲尼水溶液，持續(xù)3周。實(shí)驗(yàn)期間每隔4天記錄一次裸鼠腫瘤體積和體重。腫瘤體積 (mm3)=L1×(L2)2×0.5236，L1和L2均有游標(biāo)卡尺測(cè)量獲得，其中L2為腫瘤短直徑，L1為腫瘤長(zhǎng)直徑。給藥3周后，腹腔注射過量戊巴比妥鈉(200 mg/kg)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行安樂死，然后剝離腫瘤組織，記錄大小并保存在-80℃冰箱中用于后續(xù)Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

TRIzol提取腫瘤組織總RNA，Nano1000測(cè)定RNA濃度，同時(shí)確保A260/A280在1.8-2.0范圍內(nèi)，逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR步驟均參考試劑盒說明書。引物序列見表1，引物均由上海生工設(shè)計(jì)合成。以GAPDH作為內(nèi)參。使用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)。

表1 PCR引物序列

1.4 Westernblot實(shí)驗(yàn)

稱取適量腫瘤組織，使用手持式勻漿器在RIPA裂解液中勻漿，4℃ 12000 rpm離心15 min，BCA法測(cè)定蛋白上清的濃度。使用8-10% SDS-PAGE分離不同分子量的蛋白，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至活化后的PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1-2 h，TBST清洗30s后，轉(zhuǎn)移至稀釋好的一抗溶液中，4℃孵育過夜；次日使用TBST清洗PVDF膜三遍，每次5min，將膜轉(zhuǎn)移至稀釋好的HRP標(biāo)記二抗溶液中，室溫孵育1-2 h，TBST清洗(3次，每次5min)，ECL顯色液顯色并拍照。以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)蛋白進(jìn)行均一化比較，使用Image J進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Lut、Res對(duì)裸鼠皮下肝癌移植瘤生長(zhǎng)的影響

給藥3周結(jié)束后，剝離腫瘤組織并稱重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lut(50 mg/kg)、Res(100 mg/kg)、Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg) 和Sorafenib (30 mg/kg)組與溶劑對(duì)照組相比，腫瘤組織明顯減小，其中Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)組最為明顯，其效果優(yōu)于陽性對(duì)照藥 (Sorafenib)(圖1A)；Lut(50 mg/kg)、Res(100 mg/kg)、Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)和Sorafenib(30 mg/kg)組腫瘤質(zhì)量分別為：(0.43±0.03)g、(0.40±0.05)g、(0.21±0.03)g和 (0.28±0.06)g，與溶劑對(duì)照組(0.59±0.05)g顯著降低(P均<0.05)，其中Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)組腫瘤質(zhì)量顯著低于Sorafenib(30 mg/kg)組(P<0.05)(圖1B)；在治療過程中，各給藥組可顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng)，其中Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)抑制效果最為顯著(圖1C)，各給藥組小鼠體重與溶劑對(duì)照組相比，略有減輕，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均 >0.05)(圖1D)。

圖1 Lut、Res對(duì)裸鼠皮下肝癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 Lut、Res對(duì)腫瘤組織中NF-κB、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)的影響

各給藥組與溶劑對(duì)照組相比，腫瘤組織中NF-κB活性被顯著抑制，Bcl-2的mRNA及蛋白水平顯著下調(diào)(P均<0.05)，而Bax和Caspase-3的mRNA及蛋白水平顯著上調(diào)(P均<0.05)，其中Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)組的效果最為顯著，展現(xiàn)出較好的體內(nèi)協(xié)同作用。見圖2、圖3和表2。

圖3 Lut、Res對(duì)腫瘤組織中p-NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響

表2 腫瘤組織中p-NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)比較(±s)

表2 腫瘤組織中p-NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)比較(±s)

注：與Vehicle組相比，*P<0.05;與Lut組相比，#P<0.05;與Res組相比，&P<0.05。

Groups p-NF-κB Bcl-2 Bax Caspase-3 Vehicle 100 100 100 100 Lut 62.03±8.34* 73.22±9.68* 232.44±15.75* 193.65±12.34*Res 58.12±7.62* 66.93±8.54* 254.35±17.66* 211.35±14.89*Lut+Res 28.91±5.12*#& 19.11±4.63*#& 423.89±26.99*#& 342.67±22.79*#&

圖2 Lut、Res對(duì)腫瘤組織中NF-κB、Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA含量的影響

3 討論

據(jù)報(bào)道，全球每年新增肝癌患者超過70萬人，由于缺乏有效的治療藥物和手段，死亡率也一直居高不下[11]。近年來，藥物聯(lián)合抗癌成為研究的熱點(diǎn)，為藥物治療肝癌帶來新的希望?；谇捌隗w外研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)Lut(50 mg/kg)與Res(100 mg/kg)聯(lián)合給藥可顯著抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤生長(zhǎng)，具有一定的協(xié)同抗肝癌作用。

核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-κB，NF-κB)在腫瘤組織中異常表達(dá)并參與多種基因的調(diào)控，其中包括細(xì)胞增殖、凋亡、血管再生、轉(zhuǎn)移和耐藥相關(guān)基因[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制NF-κB的激活可有效治療膀胱癌和黑色素瘤[13,15]。木犀草素和白藜蘆醇作為兩種常見的天然產(chǎn)物，體內(nèi)外均有較好的抗癌活性。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)，腹腔注射給予50 mg/kg木犀草素可顯著抑制裸鼠食管癌移植瘤的生長(zhǎng)。Ji等[17]研究顯示，灌胃給予100mg/kg的白藜蘆醇可有效抑制小鼠體內(nèi)結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。前期體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L Lut+25 μmol/L Res可協(xié)同抑制HepG2內(nèi)NF-κB的激活，有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，展現(xiàn)優(yōu)異的協(xié)同抗肝癌的作用。但其體內(nèi)聯(lián)用是否具有同樣的藥效，通過何種機(jī)制起效及是否同樣存在協(xié)同作用，有待進(jìn)一步考證。因此，本研究選取體內(nèi)具有抗癌活性的木犀草素和白藜蘆醇給藥劑量，探討Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)的體內(nèi)抗癌活性及機(jī)制。與體外研究結(jié)果一致，Lut(50 mg/kg)+Res(100 mg/kg)可協(xié)同抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤的生長(zhǎng)且效果優(yōu)于陽性對(duì)照藥(Sorafenib)。與體外機(jī)制研究相似，這種抗癌作用與抑制NF-κB的激活密切相關(guān)，抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，介導(dǎo)了這種抗癌作用。但木犀草素聯(lián)合白藜蘆醇通過何種方式和途徑協(xié)同抑制NF-κB的激活，有待進(jìn)一步研究。

白藜蘆醇是一種天然的，被公認(rèn)的Sirt1激動(dòng)劑。研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1與NF-κB間存在調(diào)節(jié)關(guān)系，激活的Sirt1可作用于NF-κB的p65亞單位，使其Lys310的乙?；浇档停M(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)錄活性[18,19]，發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)的作用，即激活的Sirt1可通過抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。因此，我們推測(cè)白藜蘆醇可通過激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Sirt1，進(jìn)而抑制NF-κB核轉(zhuǎn)錄活性。Ma等[20]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素也存在潛在的Sirt1激動(dòng)活性，并可通過激活Sirt1誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡。除此之外，木犀草素對(duì)IKKβ/IκBα/NF-κB炎癥信號(hào)通路也有負(fù)向調(diào)節(jié)的作用，并展現(xiàn)出較好的血管炎癥作用[21]。因此，木犀草素可能是可通過激活Sirt1和抑制IKKβ/IκBα/NF-κB雙向協(xié)同抑制NF-κB的激活。綜上，我們推測(cè)，木犀草素和白藜蘆醇聯(lián)用可能通過聯(lián)合激活Sirt1和抑制IKKβ/IκBα/NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而雙重抑制瘤細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活，發(fā)揮協(xié)同抗肝癌的作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，木犀草素(50 mg/kg)和白藜蘆醇(100 mg/kg)聯(lián)用較單獨(dú)治療具有更好的體內(nèi)抗肝癌效果，其作用甚至優(yōu)于陽性對(duì)照藥(Sorafenib)。機(jī)制研究顯示，這種協(xié)同抗肝癌作用與抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡(抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3上調(diào))密切相關(guān)。同時(shí)，鑒于木犀草素和白藜蘆醇的安全性高、自然界含量豐富等優(yōu)勢(shì)，這種聯(lián)合治療方式也展現(xiàn)出良好的臨床治療和應(yīng)用前景。