6種醫(yī)院抑菌制劑的微生物限度檢查方法適用性研究Δ

李 敏，龔 亞，曹 健，樊 莉

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400037)

醫(yī)院制劑以臨床需求為導(dǎo)向，生產(chǎn)靈活，能夠彌補上市藥品供給不足等缺點，是醫(yī)院臨床用藥的重要組成部分[1]。國家衛(wèi)生健康委員會等六部委發(fā)布的《關(guān)于印發(fā)加強醫(yī)療機構(gòu)藥事管理促進合理用藥的意見的通知》[2]中指出，應(yīng)“加強醫(yī)療機構(gòu)藥品配備管理……研究醫(yī)療聯(lián)合體內(nèi)臨床急需的醫(yī)療機構(gòu)制劑調(diào)劑和使用管理制度，合理促進在醫(yī)療聯(lián)合體內(nèi)共享使用”。醫(yī)院制劑應(yīng)保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，建立質(zhì)量控制體系。微生物限度檢查是藥品質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)，對檢查方法進行適用性驗證是保證藥品檢驗結(jié)果可靠的基本要求[3]。復(fù)方替硝唑溶液[成制字(2016)B705017]、新面醑[總制字(2017)F705011]、復(fù)方呋喃西林滴鼻液[成制字(2016)B705016]、樟腦苯酚溶液[成制字(2016)B705036]、維生素E珍珠乳膏[總制字(2018)F705015]和復(fù)方碘溶液[成制字(2016)B705013]均為醫(yī)院自制制劑，上述6種制劑均有不同程度的抑菌作用[4]。制劑中的抑菌成分會干擾微生物限度檢查，故對含抑菌成分的制劑進行微生物限度檢查時，應(yīng)先消除其抑菌活性，以保證方法的適用性[5]。對于含不同抑菌成分及抑菌成分含量不同的抑菌制劑，應(yīng)建立專屬性強、重復(fù)性好的微生物限度檢查方法。本研究擬采用平皿法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法和中和法針對不同劑型、含不同抑菌成分的醫(yī)院制劑進行微生物限度適用性試驗，消除其抑菌活性，建立準(zhǔn)確可靠的微生物限度檢查方法，以用于相關(guān)制劑質(zhì)量控制檢驗。

1 材料

1.1 儀器

BP-Ⅱ型架盤天平(上海醫(yī)用激光儀器廠)；LRH-70型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；M0ST-T24-B型臺式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；CS101-2ABN型電熱鼓風(fēng)干燥箱(重慶康誠永生實驗設(shè)備有限公司)；BSC-1000-Ⅱ-A2型生物安全柜(蘇州華宇凈化設(shè)備有限公司)。

1.2 藥品

復(fù)方替硝唑溶液(成分：替硝唑、醋酸氯己定等；批號：191224)，新面醑(成分：甲硝唑、氯霉素、水楊酸等；批號：200323)，復(fù)方呋喃西林滴鼻液(成分：呋喃西林、鹽酸麻黃堿等；批號：191028)，樟腦苯酚溶液(成分：樟腦、苯酚等；批號：190905)，維生素E珍珠乳膏(成分：維生素E、珍珠粉及羥苯乙酯等；批號：200107)，復(fù)方碘溶液(成分：碘、碘化鉀等；批號：191217)，均為陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院自制。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]和大腸埃希菌[CMCC(B)44102]由中國食品藥品檢定研究院菌種保藏中心提供，均為第1代冷凍保存菌株；黑曲霉[CMCC(F)98003]由北京三藥科技開發(fā)公司提供，為第4代冷凍保存菌株。

1.4 培養(yǎng)基、試劑及稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號：180427)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：171218)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：170316)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號：161118)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號：170313)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號：171211)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號：181227)和甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號：180326)均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，經(jīng)過適用性試驗驗證，符合《中國人民共和國藥典：四部》(2015年版)的規(guī)定；聚山梨酯-80(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號：2017091901)，硫代硫酸鈉(上海強順化工有限公司，批號：20080822)；稀釋液為0.9 %氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：M19061505-1)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液的制備

取復(fù)方替硝唑溶液(A)、新面醑(B)和復(fù)方呋喃西林滴鼻液(C)各10 ml，用稀釋液逐級稀釋制成1∶ 10、1∶ 100(V/V)的供試液；取樟腦苯酚溶液(D)10 ml,加入溫?zé)崛诨木凵嚼骢?80 10 ml，用稀釋液逐級稀釋制成1∶ 10、1∶ 100(V/V)的供試液；維生素E珍珠乳膏(E)10 g，加入溫?zé)崛诨木凵嚼骢?80 10 ml，用稀釋液逐級稀釋制成1∶ 10、1∶ 100(g/V)的供試液；取復(fù)方碘溶液(F)10 ml，加入0.5 mol/ml的硫代硫酸鈉溶液10 ml，用稀釋液稀釋制成1∶ 10(V/V)的供試液。

2.2 菌液的制備

按照《中國人民共和國藥典：四部》(2015年版)通則1105和通則1106中規(guī)定的菌液制備方法，制成適宜濃度的各菌懸液。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的適用性試驗

分別取A、B、C和D供試液10 ml以薄膜過濾，用稀釋液沖洗濾膜數(shù)次，每次100 ml，在最后1次沖洗液中分別加入≤100 cfu/ml的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌懸液1 ml，混勻，過濾，取出濾膜菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上。分別取E、F供試液9.9 ml，分別加入≤10 000 cfu/ml的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌懸液0.1 ml，混勻，取1 ml置無菌平皿中，注入15～20 ml溫度≤45 ℃熔化的瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基于32.5 ℃培養(yǎng)2 d，作為需氧菌計數(shù)檢查；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基于22.5 ℃培養(yǎng)3 d，作為霉菌和酵母菌計數(shù)檢查，作為試驗組。供試品對照組以稀釋液代替菌液，菌液對照組以稀釋液代替供試液，乳化劑對照組以聚山梨酯-80代替供試品，中和劑對照組以硫代硫酸鈉溶液代替供試品，其余均同試驗組操作。

計算回收率：試驗組的回收率=(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液對照組平均菌落數(shù)；乳化劑對照組的回收率=乳化劑對照組平均菌落數(shù)/菌液對照組平均菌落數(shù)；中和劑對照組的回收率=中和劑對照組平均菌落數(shù)/菌液對照組平均菌落數(shù)。需氧菌、霉菌和酵母菌各試驗菌株的回收率見表1。供試品A、B、C和D采用薄膜過濾法經(jīng)300 ml沖洗液沖洗進行需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)檢查；供試品E以1∶ 100稀釋級進行需氧菌計數(shù)檢查，1∶ 10稀釋級進行霉菌及酵母菌計數(shù)檢查；供試品F選用0.5 mol/ml的硫代硫酸鈉溶液作為中和劑進行需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)檢查，方法可行。經(jīng)驗證，10%的聚山梨酯-80及0.5 mol/ml的硫代硫酸鈉溶液不會干擾上述各菌株的生長。

表1 需氧菌、霉菌和酵母菌各試驗菌株的回收率(n=2)Tab 1 Recovery rates of various test bacterial strains of aerobic bacteria, molds and yeasts (n=2)

2.4 控制菌檢查方法的適用性試驗

分別取1∶ 10的A、B、C和D供試液10 ml，以薄膜過濾，用稀釋液沖洗濾膜數(shù)次，每次100 ml，在最后1次沖洗液中分別加入≤100 cfu/ml的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌或大腸埃希菌的菌懸液1 ml，混勻、過濾，取出濾膜，加至適宜體積的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中；取1∶ 10的E、F供試液10 ml，及≤100 cfu/ml的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌或大腸埃希菌菌懸液1 ml，加至適宜體積的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。上述培養(yǎng)物照《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)通則1106中控制菌檢查方法進行檢查，作為試驗組。供試品對照組以稀釋液代替菌液，陰性對照組以稀釋液代替供試液和菌液，陽性對照組以稀釋液代替供試液，乳化劑對照組以聚山梨酯-80代替供試品，中和劑對照組以中和劑代替供試品，其余均同試驗組操作。

6種制劑采用不同的方法，控制菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌或大腸埃希菌可檢出，見表2。其中，復(fù)方碘溶液在供試品制備過程中加入同體積的0.5 mol/ml硫代硫酸鈉溶液進行試驗，檢查方法可行。經(jīng)驗證乳化劑及中和劑對3種菌種均無毒性。

表2 控制菌檢查的適用性試驗結(jié)果Tab 2 Results of applicability test of control bacteria detection

3 討論

本研究建立了6種有抑菌作用的醫(yī)院制劑的微生物限度檢查方法。對于具有抑菌活性的供試品，若在最低稀釋級無法進行方法適用性試驗時，根據(jù)相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響結(jié)果判斷的前提下，通過增加稀釋級的方法進行試驗。若供試品的抑菌活性較強，可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入菌液進行方法適用性試驗，必要時可聯(lián)合使用多種方法[6]。本研究選用適宜的試驗方法，有效消除了含多種抑菌成分制劑的抑菌活性。

替硝唑和甲硝唑?qū)傧趸溥蝾愃幬铮瑢捬蹙哂休^高的活性[7-9]；氯霉素和呋喃西林屬廣譜抗菌藥物，對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌有顯著的抑制作用[10-11]；醋酸氯己定為陽離子表面活性劑，對普通細菌及厭氧菌均有良好的殺菌作用，即使低濃度下也具有較強的抑菌效果[12-14]。上述藥物易溶于水，且相應(yīng)的復(fù)方替硝唑溶液、新面醑和復(fù)方呋喃西林滴鼻液3種制劑均屬液體制劑，因此，優(yōu)先采用薄膜過濾法，以消除其抑菌作用。樟腦對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌等有抗菌作用[15-16]；苯酚對細菌和霉菌均有抑菌作用，尤其對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用[17]。本研究中，對樟腦苯酚溶液采用薄膜過濾法進行微生物計數(shù)檢查，采用薄膜過濾法結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法進行控制菌檢查。維生素E珍珠乳膏因添加防腐劑羥苯乙酯而具有抑菌作用，羥苯乙酯可使微生物蛋白質(zhì)變性而起到抑制菌落生長的作用，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、酵母菌和霉菌都有一定的抑制作用[18-19]。本研究中，通過增加供試品稀釋級進行微生物計數(shù)檢查，增加接種培養(yǎng)基體積進行控制菌檢查，可消除維生素E珍珠乳膏的抑菌活性。碘因強氧化性能有效滅活病原體，對細菌、真菌、病毒及芽孢等微生物均有較強的殺滅作用[20-21]。本研究中，對復(fù)方碘溶液采用中和法，通過硫代硫酸鈉將碘還原成碘離子，從而消除其抑菌活性。

復(fù)方替硝唑溶液、新面醑、復(fù)方呋喃西林滴鼻液和樟腦苯酚溶液均采用1∶ 100稀釋級進行薄膜過濾。前期試驗及文獻報道顯示，該類制劑以1∶ 10稀釋級進行試驗時，薄膜過濾沖洗體積均>500 ml，且需多種方法聯(lián)合使用方可消除其抑菌活性，試驗耗損較大[22-24]?！吨腥A人民共和國藥典：四部》(2020年版)[25]通則中的微生物限度檢查薄膜過濾法部分新增總沖洗量一般≤500 ml，本研究中的試驗方法符合該規(guī)定。對于含多種抗菌成分的強抑菌制劑，在符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定下，通過增加供試液稀釋級再進行薄膜過濾，能有效減少沖洗液的體積；油性、乳膏等水不溶性制劑，難以被普通的稀釋液稀釋，可加入適量的乳化劑助其溶解，形成均一、穩(wěn)定的供試液，從而更加準(zhǔn)確地檢測出相應(yīng)菌種；乳膏制劑易造成薄膜堵塞，選擇培養(yǎng)基稀釋法進行試驗，從而更加簡便、準(zhǔn)確地進行微生物限度檢查；含有易于被其他物質(zhì)中和的成分的制劑，優(yōu)先采用中和法進行試驗，可克服薄膜過濾法和培養(yǎng)基稀釋法操作繁瑣且試驗耗費大等缺點。

本研究建立了含替硝唑、甲硝唑、氯霉素和呋喃西林等抗菌藥物及含醋酸氯己定、樟腦、苯酚、羥苯乙酯和碘等消毒防腐藥的微生物限度檢查方法，針對不同劑型、不同抑菌成分的制劑采用不同的試驗方法，可精準(zhǔn)消除抑菌成分對微生物限度檢查的干擾，使操作簡便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。本研究所建立的方法也同樣適用于《中華人民共和國藥典》(2020年版)標(biāo)準(zhǔn)，為醫(yī)院制劑的質(zhì)量控制提供了可靠的檢測手段，也為類似制劑的微生物限度檢查方法適用性試驗提供了參考。