三味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

梁國成，陳斯寧，陳舒茵，楊紅梅，黃小鷗，覃忠桂,3，秦 辛，韋世民,3

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥物研發(fā)中心，廣西 南寧 530011； 2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004； 3.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200)

三味板藍(lán)根顆粒是廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院臨床常用的醫(yī)院制劑(批準(zhǔn)文號：桂藥制字Z01060082)，其處方簡單，僅由板藍(lán)根、貫眾和山芝麻3味中藥組成，其中板藍(lán)根為傳統(tǒng)的清熱解毒藥，貫眾與山芝麻是廣西壯族自治區(qū)特色壯瑤藥，該制劑極具地方特色，具有清熱解毒、涼血利咽和消腫的功效，在臨床常被用于扁桃體炎、腮腺炎、咽喉腫痛以及病毒性肝炎等的防治。三味板藍(lán)根顆粒在臨床上已有超過四十年的使用歷史，其原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)偏低，已無法適應(yīng)如今中藥、民族藥制劑發(fā)展以及中藥制劑現(xiàn)代化的相關(guān)要求。因此，本研究開展了醫(yī)院制劑三味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究，在前期工藝改良的前提下，進(jìn)一步增加薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)、紫外-可見分光光度法(ultraviolet and visible spectrophotometry，UV-Vis)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)等檢測技術(shù)和手段，探討提升原制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為控制該制劑的質(zhì)量提供參考和依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

L6型紫外可見分光計[上海儀電(集團(tuán))有限公司]；D27型超聲波清洗機(廣東固特超聲股份有限公司)；JJ500型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；AE240型分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；101-38型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱(上海滬越實驗儀器有限公司)；LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)。

1.2 藥品與試劑

三味板藍(lán)根顆粒處方藥材均購自廣西柳州百草堂中藥飲片廠有限責(zé)任公司(板藍(lán)根批號為20200209，貫眾批號為20170902，山芝麻批號為20170814)；三味板藍(lán)根顆粒(自制，批號為20200511-TS01、20200511-TS02、20200511-TS03、20200511-TS04、20200511-TS05和20200511-TS06)；(R,S)-告依春對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為111753-201706)；β-谷甾醇(中國食品藥品檢定研究院，批號為110851-201909)；靛玉紅(中國食品藥品檢定研究院，批號為110717-201805)。石油醚(60～90 ℃)(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號為2018101701)；乙酸乙酯(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號為2018120501)；甲醇(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號為2020041402)；苯酚(成都金山化學(xué)試劑有限公司，批號為20170816)；冰醋酸(上海吳涇化工有限公司，批號為20110101)；氫氧化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號為20191101)；碳酸氫鈉(新興凌云醫(yī)藥化工有限公司，批號為03832550)，均為分析純。無水乙醇(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號為2020082702)；色譜甲醇(美國Tedia公司，批號為14060185)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)，批號為202008171113GS 07645)；10%硫酸乙醇溶液(自制)；純化水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別研究與結(jié)果

2.1.1 板藍(lán)根的TLC鑒別：稱取三味板藍(lán)根顆粒成品顆粒10 g，加入80%甲醇50 ml溶解并超聲處理30 min(頻率為40 kHz，功率為600 W)，過濾，將所得濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml溶解，作為供試品溶液。另取板藍(lán)根對照藥材2 g和缺板藍(lán)根的陰性樣品顆粒10 g，分別加入80%甲醇10和50 ml，同法制成板藍(lán)根對照藥材溶液和陰性樣品溶液。再精密稱取(R,S)-告依春對照品，加入甲醇溶解制成0.5 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。按照《中華人民共和國藥典：一部》(2020年版)[1]中“板藍(lán)根”鑒別項、《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)[2]通則0502中TLC法進(jìn)行試驗，吸取上述4種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(V∶V=1∶1)為展開劑，在層析缸中預(yù)飽和后展開，取出晾干后置于紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)位置上，分別顯相同顏色斑點，且陰性無干擾，見圖1。

1.(R,S)-告依春對照品；2.板藍(lán)根對照藥材；3.三味板藍(lán)根顆粒供試品；4.陰性樣品1.(R,S)-goitrin reference; 2.radix isatidis reference; 3.test sample of Sanwei radix isatidis granules; 4.negative sample圖1 板藍(lán)根的TLC色譜鑒別圖Fig 1 TLC chromatographic identification of radix isatidis

2.1.2 山芝麻的TLC鑒別：稱取三味板藍(lán)根顆粒成品顆粒10 g，加入甲醇50 ml溶解并超聲處理30 min(頻率為40 kHz，功率為600 W)，放冷，過濾，將所得濾液蒸干，殘渣加入甲醇1 ml溶解，作為供試品溶液。另取山芝麻對照藥材2 g和缺山芝麻的陰性樣品顆粒10 g，分別加入甲醇10和50 ml，同法制成對照藥材溶液和陰性樣品溶液。再精密稱取β-谷甾醇對照品，加入甲醇溶解制成0.5 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。按照《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)通則0502中TLC法進(jìn)行試驗，吸取上述4種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(V∶V=7∶1)為展開劑，在層析缸中預(yù)飽和后展開，取出晾干后均勻噴以10%硫酸乙醇溶液，放置于105 ℃烘箱中加熱至斑點顯色清晰[3-4]。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)位置上，分別顯相同顏色斑點，且陰性無干擾，見圖2。

1.β-谷甾醇對照品；2.三味板藍(lán)根顆粒供試品；3.山芝麻對照藥材；4.陰性樣品1.β-sitosterol reference; 2.test sample of Sanwei radix isatidis granules; 3.screwtree root reference; 4. negative sample圖2 貫眾的TLC色譜鑒別圖Fig 2 TLC chromatographic identification of cyrtomium fortunei

2.2 多糖含量測定研究與結(jié)果

2.2.1 溶液的制備：(1)對照品溶液的制備。取適量先于105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖對照品，精密稱取25 mg置于25 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再取5 ml溶液轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中并加水稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/ml的對照品溶液。(2)供試品溶液的制備。稱取三味板藍(lán)根顆粒10 g，加入1 ml/mol的氫氧化鈉溶液50 ml，在80 ℃的水中超聲處理50 min(頻率為40 kHz，功率為600 W)，用10%醋酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性，過濾，精密吸取續(xù)濾液1 ml轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中并加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。(3)5%苯酚溶液的制備。稱取苯酚100 g，加鋁粉0.1 g及碳酸氫鈉粉末0.05 g，采用常壓蒸餾法收集181～182 ℃的餾分，稱取該冷凝后的餾分5 g，加水定容于100 ml的棕色容量瓶中，即得5%苯酚溶液。

2.2.2 檢測波長的確定：按照《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)通則0401中UV-Vis法進(jìn)行試驗[2]。精密吸取對照品溶液和供試品溶液各0.5 ml，分別置于10 ml容量瓶中，分別加入5%苯酚溶液1 ml，搖勻，再分別加入濃硫酸5 ml邊加邊震蕩，移至45 ℃水浴中放置30 min后再移至冰水浴中放置30 min。放置至室溫(25 ℃)后，在紫外-可見分光光度計上測定波長400～500 nm之間的吸光度，結(jié)果顯示，兩者均在486 nm處有最大吸收(見圖3—4)，故選擇486 nm為測定波長。

圖3 對照品溶液不同波長的吸光度曲線Fig 3 Absorbance curves of reference solution at different wavelengths

圖4 供試品溶液不同波長的吸光度曲線Fig 4 Absorbance curves of test solution at different wavelengths

2.2.3 方法學(xué)驗證：(1)線性關(guān)系的確定。精密吸取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 ml，分別置于10 ml容量瓶中，補加蒸餾水至1.0 ml，加入5%苯酚溶液1 ml，搖勻，再加入濃硫酸5 ml，再次混合均勻后，轉(zhuǎn)移至45 ℃水浴中保溫30 min，取出冷卻至室溫，于486 nm處測定吸光度。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以吸光度值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=6.215X+0.059 3，R2=0.999 1。結(jié)果表明，葡萄糖對照品溶液在0.02～0.10 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。(2)精密度試驗。取葡萄糖對照品，按照“2.2.1”項下對照品溶液的制備方法，制得葡萄糖對照品溶液，按照“2.2.2”項下方法處理后測定，連續(xù)測定吸光度6次。結(jié)果顯示，葡萄糖對照品溶液的吸光度分別為0.722、0.714、0.718、0.718、0.717和0.717，RSD為0.33%，表明儀器精密度良好。(3)重復(fù)性試驗。稱取6份同一批三味板藍(lán)根顆粒(批號為20200511-TS01)適量，按照“2.2.1”項下供試品溶液的制備方法，制得6份供試品溶液，按照“2.2.2”項下方法處理后測定，記錄各吸光度。結(jié)果顯示，各樣品的吸光度分別為0.450、0.434、0.450、0.439、0.468和0.443，RSD為2.43%，表明方法重復(fù)性良好。(4)穩(wěn)定性試驗。取同一批三味板藍(lán)根顆粒(批號為20200511-TS01)供試品溶液，于室溫下放置，分別于0、30、60、90、120和150 min時按照“2.2.2”項下擬定條件測定，記錄吸光度。結(jié)果顯示，各樣品的吸光度分別為0.450、0.444、0.443、0.444、0.440和0.428，RSD為1.52%，表明三味板藍(lán)根顆粒供試品溶液試樣在室溫下放置150 min內(nèi)的穩(wěn)定性良好。(5)回收率試驗。取已知含量的同一批三味板藍(lán)根顆粒(批號為20200511-TS01)9份，每份10 g，分別按低劑量、中劑量和高劑量加入葡萄糖對照品0.225 0、0.450 0和0.900 0 mg各3份，使每3份葡萄糖對照品成分的含量約為樣品顆粒葡萄糖含有量的0.5、1.0和1.5倍，按照“2.2.1”項下供試品溶液的制備方法，制得樣品溶液，再按“2.2.2”項下擬定條件測定，記錄吸光度。結(jié)果顯示，低劑量、中劑量和高劑量3種加入劑量的樣品溶液的平均加樣回收率分別為101.54%、101.48%和101.54%，RSD分別為0.70%、0.71%和0.45%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.2.4 多糖含量測定：取6批三味板藍(lán)根顆粒樣品，按照“2.2.1”項下供試品溶液的制備方法，制得樣品溶液，再按照“2.2.2”項下擬定條件測定，重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄吸光度。結(jié)果顯示，6批三味板藍(lán)根顆粒中多糖含量分別為6.31%、6.27%、6.25%、6.33%、6.37%和6.35%，平均含量為6.31%，RSD為0.67%。

2.3 (R,S)-告依春含量測定研究與結(jié)果

2.3.1 溶液的制備：(1)對照品溶液的制備。精密稱取(R,S)-告依春對照品2.0 mg，置于50 ml容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，再精密吸取20 ml，置于50 ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為16 μg/ml的溶液，以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為對照品溶液。(2)供試品溶液的制備。取三味板藍(lán)根顆粒樣品顆粒5 g，精密稱定，置于具塞三角錐形瓶中，加純化水25 ml，精密稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(頻率為40 kHz，功率為600 W)，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，以純化水補足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。(3)陰性樣品溶液的制備。取缺板藍(lán)根藥材的陰性樣品顆粒5 g，按照“2.3.1”項下供試品溶液的制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.3.2 色譜條件的確定：色譜柱為Waters Symmetry Shield RP18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(V∶V=15∶85)，體積流量為1.0 ml/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為245 nm，進(jìn)樣量為5 μl。按照《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)[2]通則0512中HPLC法進(jìn)行試驗。HPLC圖見圖5—7。

圖5 (R,S)-告依春對照品的HPLC色譜圖Fig 5 HPLC chromatogram of (R,S)-goitrin reference

圖6 供試品的HPLC色譜圖Fig 6 HPLC chromatogram of test sample

圖7 陰性樣品的HPLC色譜圖Fig 7 HPLC chromatogram of negative sample

2.3.3 方法學(xué)驗證：(1)線性及線性關(guān)系。精密吸取“2.3.1”項下制備的(R,S)-告依春對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml，分別置于10 ml容量瓶中，以甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，按照“2.3.2”項下擬定的色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄色譜圖。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=6.0×106X+155 05，R2=0.999 7。結(jié)果表明，在0.008～0.045 μg內(nèi)線性關(guān)系良好。(2)精密度試驗。取“2.3.1”項下制備的(R,S)-告依春對照品溶液，按照“2.3.2”項下擬定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰面積。結(jié)果顯示，色譜峰面積的RSD為1.81%，表明儀器精密度良好。(3)重復(fù)性試驗。分別稱取6份同一批(批號為20200511-TS01)三味板藍(lán)根顆粒處方藥材適量，按照“2.3.1”項下供試品溶液的制備方法，制備6份供試品溶液，按照“2.3.2”項下擬定的色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積并計算(R,S)-告依春含量。結(jié)果顯示，(R,S)-告依春平均含量為0.036 9 mg/g，RSD為1.46%，表明方法重復(fù)性良好。(4)穩(wěn)定性試驗。取同一批“2.3.1”項下制備的三味板藍(lán)根顆粒(批號為20200511-TS01)供試品溶液，于室溫下放置，分別于0、1、2、4、8、12和24 h，按“2.3.2”項下擬定的色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，RSD為0.51%，表明三味板藍(lán)根顆粒供試品溶液試樣在室溫下放置24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。(5)回收率試驗。取已知含量的同一批三味板藍(lán)根顆粒(批號為20200511-TS01)9份，每份5 g，分別按照低劑量、中劑量和高劑量加入(R,S)-告依春對照品0.092 3、0.184 5和0.276 8 mg各3份，使每3份(R,S)-告依春成分的含量約為樣品顆粒(R,S)-告依春含有量的0.5、1.0和1.5倍，按照“2.3.1”項下供試品溶液的制備方法，制得樣品溶液，再按照“2.3.2”項下擬定的色譜條件測定，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，低劑量、中劑量和高劑量3種加入劑量的樣品溶液的平均加樣回收率分別為98.81%、100.16%和101.06%，RSD分別為1.32%、0.84%和0.80%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.3.4 (R,S)-告依春含量測定：取6批三味板藍(lán)根顆粒樣品，按照“2.3.1”項下供試品溶液的制備方法，制得樣品溶液，再按照“2.3.2”項下擬定的色譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，6批三味板藍(lán)根顆粒中(R,S)-告依春的含量分別為0.034 6、0.037 2、0.038 0、0.035 9、0.031 4和0.035 7 mg/g，平均含量為0.035 5 mg/g，RSD為5.98%。

3 討論

三味板藍(lán)根顆粒為廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院臨床傳統(tǒng)的中藥復(fù)方制劑，處方組成雖然簡單，但是四十余年的臨床應(yīng)用證實其藥效確切，且該制劑為顆粒劑，攜帶、服用方便。該制劑處方中含廣西地區(qū)特色中藥貫眾、特色壯瑤藥山芝麻，極具民族地方特色。因此，加強對該制劑的深入研究與二次開發(fā)，以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和提升，對深入挖掘地方中藥和民族藥，推廣、壯大廣西地區(qū)特色中藥和民族藥具有積極的作用。

本研究中，對三味板藍(lán)根顆粒處方藥材進(jìn)行了TLC定性鑒別。在板藍(lán)根的定性鑒別中，同時考察了3、5和10 μl的點樣量，發(fā)現(xiàn)點樣量為3 μl時斑點顯色較淡，點樣量為5和10 μl時斑點顯色清晰，故點樣量定為5 μl即可達(dá)到要求。在山芝麻的定性鑒別色譜研究中，對供試品的制備進(jìn)行了比較，當(dāng)以水、甲醇和正丁醇等為溶劑進(jìn)行供試品制備時，得到的供試品雜質(zhì)較多，造成拖尾，尤其以甲醇為溶劑進(jìn)行提取時雜質(zhì)最多，與相關(guān)文獻(xiàn)報道相符[5]。以乙酸乙酯進(jìn)行供試品溶液的制備時，TLC色譜圖中斑點清晰。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，山芝麻的乙酸乙酯部位雜質(zhì)干擾較少，HPLC色譜圖顯示各成分色譜峰分離度良好[6]；相關(guān)抑菌試驗結(jié)果表明，山芝麻的乙酸乙酯部位為抑菌活性部位之一[7]。因此，本研究選擇乙酸乙酯進(jìn)行供試品溶液的制備。此外，嘗試對處方中貫眾藥材進(jìn)行了TLC定性鑒別，采用環(huán)己烷法制備供試品溶液，以正己烷-三氯甲烷-甲醇(V∶V∶V=30∶15∶1)展開，以0.3%堅勞藍(lán)BB鹽的稀乙醇溶液顯色，效果不理想，斑點不清晰，干擾多，故暫不列入本次質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍，留待后期持續(xù)研究加以完善。

文獻(xiàn)資料顯示，板藍(lán)根(Isatidis Radix)為十字花科植物菘藍(lán)IsatisindigoticaFort. 的干燥根[1]；主要含多糖類、生物堿類和黃酮類等多種活性成分，多糖為其主要有效成分之一，具有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[8-10]?！稄V西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1990年版)[11]收錄了貫眾(Rhizoma Osmundae Seu Blechnj Braineae)，為紫萁蕨科華南紫萁OsmundavachelliiHook.、烏毛蕨科植物烏毛蕨BlechnumorientaleL. 或蘇鐵蕨Braineainsignis(Hook.) J. Sm. 的干燥根狀莖；主要含多糖類、黃酮類和生物堿類等成分[12-13]。山芝麻(Radix seu herba Helicteris)為梧桐科植物山芝麻HelicteresangustifoliaL. 的干燥根或全株[14]；主要含多糖類、三萜類和香豆素等成分[15-16]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果證實，植物多糖具有多種藥理活性，如增強免疫、抗氧化和降血糖等[17-19]。故本研究質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，以多糖含量作為總物質(zhì)含量測定指標(biāo)之一。此外，關(guān)于多糖顯色測定方法，苯酚-硫酸法為測定多糖含量較經(jīng)典、有效的方法之一。本研究中使用氫氧化鈉提取多糖，為避免多糖在堿性溶液中不穩(wěn)定水解，加入10%醋酸調(diào)節(jié)pH至中性。通過全波長掃描選定了486 nm為測定波長，與相關(guān)文獻(xiàn)中多糖的檢測波長存在稍微差異[20-21]，可能與試驗時實際情況及環(huán)境相關(guān)。穩(wěn)定性試驗中發(fā)現(xiàn)，多糖顯色后在15 min內(nèi)穩(wěn)定，故應(yīng)在顯色15 min內(nèi)完成測定，避免誤差。

綜上所述，本研究為醫(yī)院制劑三味板藍(lán)根顆粒建立了較為完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且檢驗方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好、可操作性強，為今后三味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升及修訂提供了依據(jù)。