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    錯配修復蛋白缺失相關(guān)子宮內(nèi)膜癌的病理特征及其臨床意義

    2021-09-16 02:44:16鄧茜雷瓊李璐高尤亮俞文英嚴俊龍郭亞男鄭時玉李海莉蒙伶俐盧立霞李征夏朝霞
    浙江醫(yī)學 2021年16期
    關(guān)鍵詞:免疫組化陰性內(nèi)膜

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    Lynch綜合征即遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(hereditary non-polyposis colorec-tal cancer,HNPCC)屬于常染色體顯性遺傳病。人體堿基錯配修復(mismatch repair,MMR)基因胚系突變后可導致遺傳不穩(wěn)定性,引起廣泛的腫瘤易感性。其中女性Lynch綜合征患者最常發(fā)生的是卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)[1],一部分女性Lynch綜合征患者以EC為首發(fā)腫瘤,因此在EC患者中篩查Lynch綜合征是可行且必要的。Lynch綜合征確診需依靠費用昂貴的二代測序(next generation sequencing,NGS)檢測MMR基因胚系突變,無法進行大規(guī)模普篩工作,而日常工作中使用的免疫組化檢測MMR蛋白的方法經(jīng)濟快捷,是初步篩查Lynch綜合征的有效手段[2]。目前國內(nèi)有關(guān)MMR蛋白缺陷相關(guān)子宮內(nèi)膜癌(MMR protein deletion-related endometrial carcinoma,dMMR-EC)的研究較少,因此本研究旨在探討dMMR-EC患者的臨床病理特征及其臨床意義,以便指導臨床工作中初步篩查Lynch綜合征患者,進而指導下一步的治療方法和疾病管理。

    1 對象和方法

    1.1 對象 選取2014年6月至2017年6月寧波市臨床病理診斷中心診斷的EC患者294例,年齡28~86(56.4±9.4)歲。納入的EC組織學類型有:子宮內(nèi)膜樣癌、漿液性癌、透明細胞癌、混合性腺癌、子宮癌肉瘤、未分化癌和去分化癌。組織學類型不包括中腎腺癌、中腎樣腺癌、鱗狀細胞癌、胃腸型黏液腺癌、轉(zhuǎn)移性癌以及宮頸腺癌累及宮體等。本研究經(jīng)本中心醫(yī)學倫理委員會批準,所有患者均知情同意。

    1.2 病理檢查 復閱所有患者經(jīng)HE染色后的組織切片,觀察腫瘤組織形態(tài)學特征、組織學類型、肌層浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織學分級分期[按國際婦產(chǎn)科協(xié)會(Federation International of Gynecology and Obstetrics,F(xiàn)IGO)標準執(zhí)行]等臨床病理學特征。

    1.3 免疫組化檢測及其抗體信息 所有標本均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定、脫水、包埋、4 μm切片。免疫組化采用Ventana Benchmark XT自動免疫組化儀(美國Ventana公司)染色。一抗:鼠抗人單克隆抗體MLHl(克隆號:ES05)和兔抗人單克隆抗體MSH2(克隆號:RED2)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,兔抗人單克隆抗體MSH6(克隆號:EP49)購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司,兔抗人單克隆抗體PMS2(克隆號:EP51)購自河南賽諾特生物技術(shù)開發(fā)有限公司。以每張切片中淋巴細胞、纖維間質(zhì)細胞或癌旁子宮內(nèi)膜腺體的胞核陽性為陽性內(nèi)對照,陰性內(nèi)對照使用PBS代替一抗。

    1.4 二代測序及其主要試劑盒、儀器 每例需進行二代測序的患者均挑取一個含癌組織的蠟塊,切成蠟卷,采用QIAamp DNA FFPE Tissue提取試劑盒(德國QIAGEN公司)提取組織內(nèi)DNA后使用二代測序儀(型號:Hiseq 4000,美國Illumina公司)進行MMR基因的二代測序檢測,DNA capture probes購自南京世和基因生物技術(shù)有限公司。

    1.5 結(jié)果判讀 MMR蛋白(包括MLH1、PMS2、MSH2和MSH6)在任何腫瘤細胞核明確著色即判定為陽性(如圖 1、2、4、5,插頁)[3];所有腫瘤細胞核均不著色時即為陰性(如圖3、6,插頁)。間質(zhì)淋巴細胞、纖維組織細胞及癌旁子宮內(nèi)膜腺體均可作為陽性內(nèi)對照,有助于分辨假陽性或假陰性。

    圖1 子宮內(nèi)膜樣癌病理切片所見(HE染色,×100)

    圖2 子宮內(nèi)膜樣癌中MLH1陽性表達(周圍纖維間質(zhì)細胞或淋巴細胞陽性表達,陽性內(nèi)對照;免疫組化染色,×100)

    圖3 子宮內(nèi)膜樣癌中MSH6陰性表達(周圍纖維間質(zhì)細胞或淋巴細胞陽性表達,陽性內(nèi)對照;免疫組化染色,×100)

    圖4 子宮內(nèi)膜透明細胞癌病理切片所見(HE染色,×100)

    圖5 透明細胞癌中MSH2陽性表達(周圍癌旁子宮內(nèi)膜腺體陽性表達,陽性內(nèi)對照;免疫組化染色,×100)

    圖6 透明細胞癌中PMS2陰性表達(周圍癌旁子宮內(nèi)膜腺體陽性表達,陽性內(nèi)對照;免疫組化染色,×100)

    1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示,組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 一般臨床資料 294例EC石蠟包埋標本中,診斷學刮宮(以下簡稱診刮)標本22例,其余272例中有57例未清掃盆腔淋巴結(jié),另外215例為EC根治標本?;颊吣挲g<50歲者72例,≥50歲者222例。組織學類型如下:子宮內(nèi)膜樣癌242例,平均年齡54.7歲;Ⅱ型EC有43例,其中透明細胞癌12例(平均年齡70.7歲),漿液性癌23例(平均年齡64.7歲),癌肉瘤8例(平均年齡59.6歲);Ⅰ型和Ⅱ型混合性腺癌2例(平均年齡56.5歲);去分化癌5例(平均年齡57.4歲);未分化癌2例(平均年齡55.5歲)。242例子宮內(nèi)膜樣癌中不同F(xiàn)IGO分級占比分別為:Ⅰ級144例(59.5%),平均年齡52.5歲;Ⅱ級76例(31.4%),平均年齡57.1歲;Ⅲ級22例(9.1%),平均年齡61.0歲。FIGO分期:175例Ⅰ型子宮內(nèi)膜樣癌根治標本中Ⅰ期137例(78.3%),Ⅱ期25例(14.3%),Ⅲ期13例(7.4%),Ⅳ期0例(0.0%)。23例漿液性癌中18例為根治標本,F(xiàn)IGO分期分別為Ⅰ期10例,Ⅱ期2例,Ⅲ期6例,Ⅳ期0例。12例透明細胞癌中10例為根治標本,F(xiàn)IGO分期為Ⅰ期5例,Ⅱ期3例,Ⅲ期2例,Ⅳ期0例。8例癌肉瘤中6例為根治標本,F(xiàn)IGO分期Ⅰ期4例,Ⅱ期0例,Ⅲ期2例,Ⅳ期0例。5例去分化EC中,4例非診刮標本FIGO分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期者分別各占1例。2例未分化癌均為根治標本,F(xiàn)IGO分期分別為Ⅰ期和Ⅱ期。混合型癌2例其中1例為根治標本,F(xiàn)IGO分期為Ⅰ期。

    2.2 MMR蛋白表達情況 294例EC患者中,62例出現(xiàn)MMR蛋白的陰性表達,即為dMMR-EC患者,其余232例MMR蛋白陽性表達。多種組織學類型的EC均可出現(xiàn)MMR蛋白陰性表達(MMR陰性例數(shù)/總例數(shù)):子宮內(nèi)膜樣癌(53/242)、透明細胞癌(1/12)、漿液性癌(2/23)、混合性腺癌(1/2)、癌肉瘤(2/8)、未分化癌(1/2)及去分化癌(2/5)。62例MMR蛋白陰性表達的EC患者可以出現(xiàn)特定組合內(nèi)的單個MMR蛋白陰性表達,也可以出現(xiàn)特定組合內(nèi)的2個MMR蛋白共同陰性表達,但未出現(xiàn)兩個特定組合內(nèi)的蛋白均陰性表達或交叉陰性表達的現(xiàn)象。本組研究62例dMMR-EC(陰性率21.1%)中,MLH1和(或)PMS2陰性表達40例(陰性率13.6%),MSH2和(或)MSH6陰性表達22例(陰性率7.5%)。

    2.3 MMR基因二代測序結(jié)果 由于經(jīng)費限制,本研究從62例dMMR-EC患者中按分層隨機的方法挑選出21例進行二代測序檢測MMR基因表達頻譜,進行免疫組化結(jié)果的驗證,結(jié)果21例dMMR-EC患者中有18例腫瘤組織內(nèi)檢測出MMR基因突變,其中10例MSH2和(或)MSH6蛋白陰性組織均出現(xiàn)MMR基因突變,11例MLH1和(或)PMS2蛋白陰性組織中有6例出現(xiàn)MMR基因突變,如圖7(插頁)。

    圖7 21例dMMR-EC二代測序MMR基因表達頻譜(dMMR-EC為錯配修復蛋白缺失相關(guān)子宮內(nèi)膜癌;MMR為錯配修復)

    2.4 MMR蛋白陰性率與患者臨床病理特征的關(guān)系MMR蛋白陰性率與年齡、組織學類型、非診刮標本肌層浸潤深度、根治標本淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、FIGO分級和分期均無相關(guān)性(均P>0.05)。而非Ⅱ型高級別EC患者MMR蛋白陰性率明顯高于Ⅱ型高級別EC患者MMR蛋白陰性率,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

    表1 MMR蛋白陰性率與EC患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

    2.5 隨訪結(jié)果 62例dMMR-EC患者均進行電話隨訪,隨訪時間25~62個月,有效隨訪52例,其中無病生存49例,遠處轉(zhuǎn)移2例(隨訪時間分別為40和34個月),病死1例(隨訪時間為60個月);失訪10例。

    3 討論

    人類MMR基因可以識別和修復DNA復制和重組過程中發(fā)生的錯誤性堿基插入、缺失和一部分DNA損傷,保證DNA高保真復制,維持染色體的穩(wěn)定性[4]。MMR基因缺陷細胞的堿基突變率是正常堿基10到1 000倍[5]。目前研究較多的MMR基因類型主要是MLH1、PMS2、MSH2 和 MSH6[6]。

    MMR基因缺陷有兩種情況,一種是可遺傳的種系或胚系突變,常常導致Lynch綜合征;另一種就是不可遺傳的體細胞或腫瘤細胞突變。篩查dMMR-EC對識別高復發(fā)風險[7-8]或遺傳性EC患者(如Lynch綜合征)有幫助[8-9]。

    Lynch綜合征是MMR基因發(fā)生種系或胚系突變所致的一種常染色體顯性遺傳性疾病,表現(xiàn)為多系統(tǒng)多器官腫瘤易感性(多種組織癌變概率大大增加,如胃、女性生殖道、膽道、尿道、小腸、大腦和胰腺等)。女性Lynch征患者最常發(fā)生的腫瘤是卵巢癌和EC[1],一部分Lynch綜合征患者以EC為首發(fā)腫瘤。因此,在EC患者中開展Lynch綜合征篩查是可行而必要的,便于及時發(fā)現(xiàn)和預防患者Lynch綜合征相關(guān)的其他腫瘤的發(fā)生。此外,Lynch綜合征親屬也可以盡早進行遺傳咨詢及基因檢測,預防發(fā)生Lynch綜合征相關(guān)腫瘤。

    免疫組化檢測MMR蛋白的表達是篩查Lynch綜合征相關(guān)腫瘤的有效方法,已經(jīng)普遍應用于篩查Lynch綜合征相關(guān)結(jié)直腸癌患者的工作流程[2],近年來Lynch綜合征相關(guān)EC(Lynch syndrome-related endometrial cancer,Lynch-EC)備受關(guān)注,Scnter等和 Frolova 等[10-11]的研究顯示與MMR基因檢測結(jié)果比較,免疫組化法檢測MMR蛋白的靈敏度、特異度分別為0.91、0.88,因此推薦將免疫組化檢測MMR蛋白作為Lynch-EC的初篩手段。近年來,就Lynch-EC的具體篩查方案、臨床病理學特征、治療及預后等是研究熱點[12-15]。因此,本研究通過免疫組化檢測MMR蛋白的表達初步篩查Lynch-EC展開相關(guān)研究。

    本組研究中294例EC患者的MMR蛋白陰性率為21.1%(62/294),其中 MLH1和(或)PMS2蛋白陰性率13.6%(40/294),MSH2和(或)MSH6蛋白陰性率 7.5%(22/294),MMR蛋白陰性率在大多數(shù)國內(nèi)外研究報道的范圍內(nèi),但略低于某些國外報道的45%[16],有可能是篩查種群及地域不一樣所致。此外,本研究結(jié)果表明多種組織學類型的EC,包括子宮內(nèi)膜樣癌、透明細胞癌、漿液性癌、混合性腺癌、癌肉瘤、未分化癌及去分化癌等均可出現(xiàn)MMR蛋白陰性表達。除此以外,不論患者年齡是否<50歲、腫瘤浸潤肌層是否>1/2、是否具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO分級分期程度,MMR蛋白陰性率均無統(tǒng)計學差異。此結(jié)果支持推薦所有初次確診的EC均進行MMR蛋白檢測以達到Lynch-EC初篩的目的。這一結(jié)論與國內(nèi)外主流觀點基本一致[17],但Ruiz等[18]的研究表明MMR蛋白陰性病例更常見于浸潤深度<1/2肌層的病例,而Long等[19]的研究報道MMR蛋白陰性病例具有更深的肌層浸潤,可能是研究對象地域不同所致,也可能數(shù)據(jù)量有限,這需要大數(shù)量級數(shù)據(jù)進一步研究。此外,Pina等[20]研究報道顯示,組織學類型為去分化EC更容易出現(xiàn)出現(xiàn)MMR蛋白陰性,而本研究入組的去分化EC患者例數(shù)較少,難以進行統(tǒng)計學分析,因此,有待收集更多的病例進一步研究。

    國內(nèi)外多項研究均進行了低級別EC和高級別EC中MMR陰性率的比較,結(jié)果它們的陰性率比較差異均無統(tǒng)計學意義,本研究結(jié)果跟上述結(jié)果一致,但本研究進一步把高級別EC分成Ⅱ型癌和非Ⅱ型癌兩組,統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)非Ⅱ型高級別EC患者MMR蛋白陰性率(35.5%,11/31)高于Ⅱ型高級別EC患者的(11.6%,5/43),也就是說,組織學類型為非Ⅱ型高級別的EC時應作為Lynch-EC的重點篩查對象,應特別注意是否有MMR蛋白陰性,并進一步明確是否為Lynch-EC。

    2013年,美國癌癥基因組圖譜提出將EC區(qū)分為DNA聚合酶ε(POLE)突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite Instability,MSI)高突變型、高拷貝數(shù)型和低拷貝數(shù)型4種分子亞型[21]。2015年Talhouk等[22]使用免疫組化替代基因分型的方案,證明基于免疫組化檢測MMR蛋白篩選MSI高突變型EC是可行的。2020年,EC的分子分型以及基于免疫組化的分子分型方案被正式寫入第5版《WHO女性生殖腫瘤分類》中并且指出這4種分子分型中POLE突變型和MSI高突變型預后最好,其次為低拷貝數(shù)型,而高拷貝數(shù)型預后最差。本研究篩選的62例dMMR-EC基本可等同于MSI高突變型EC,預后相對較好,隨訪資料與此相符。對部分dMMR-EC(21例)進行的基因水平的驗證,結(jié)果21例dMMR-EC中16例出現(xiàn)對應MMR基因突變(16/21,76.2%),其中10例MSH2和/或MSH6蛋白陰性的病例NGS結(jié)果均出現(xiàn)對應的基因突變(10/10,100.0%),11例 MLH1和/或 PMS2蛋白陰性的病例6例NGS結(jié)果出現(xiàn)對應的基因突變(6/11,54.5%),說明MSH2和/或MSH6的免疫組化與NGS基因檢測結(jié)果的一致性優(yōu)于MLH1和(或)PMS2的。

    眾多研究表明MMR缺失的多種腫瘤(包括dMMREC)受益于程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)單抗的治療。2015 年,Le 等[23]的研 究 顯示PD-1單抗pembrolizumab對MMR缺陷型腫瘤的治療作用明顯高于MMR正常表達的腫瘤。2017年,Le等[24]研究發(fā)現(xiàn)12種MMR缺陷型腫瘤的86例晚期患者使用pembrolizumab治療后,57%的患者出現(xiàn)影像學層面的病情緩解,21%的患者獲得完全緩解。2017年6月,美國臨床腫瘤協(xié)會推薦PD-1單抗治療EC尤其是dMMR-EC患者[25]。因此,臨床工作中篩查出dMMR-EC患者對其進一步的治療具有一定的指導意義,這一點在一些需要術(shù)后輔助治療的高級別EC中顯得尤其重要。這也是本研究的意義之一:把高級別EC里的dMMR-EC用免疫組化篩選出,可以個體化制定有效的治療方案。

    綜上所述,本研究通過免疫組化檢測EC中MMR蛋白的表達,分析EC組織中MMR蛋白陰性率與其臨床病理特征的相關(guān)性,指出推薦所有初次確診的EC患者進行免疫組化檢測MMR蛋白的表達,進行Lynch-EC初篩,其中非Ⅱ型高級別EC是重點篩查對象。本研究進一步討論了在實際臨床工作中使用免疫組化檢測EC組織中 MMR蛋白的表達意義:(1)有助于開展Lynch-EC的初篩工作,對預防Lynch-EC患者本人再次發(fā)生或家族其他成員發(fā)生Lynch綜合征相關(guān)的腫瘤有一定意義;(2)有助于將預后不同的高級別EC進行分組,并指導相應的藥物治療(如可受益于PD-1單抗治療),利于高級別EC的疾病管理。

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