優(yōu)化CD45免疫磁珠陰性篩選法提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集效率的實(shí)驗(yàn)研究

蔣來(lái) 劉勇 楊立濤

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率位居世界惡性腫瘤的第三位，其中美國(guó)、歐洲和東亞地區(qū)人群發(fā)病率較高[1]。對(duì)于局部晚期和轉(zhuǎn)移性CRC患者，雖然采取多學(xué)科綜合治療，但仍有近1/3的患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移和疾病進(jìn)展[2]。隨著轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)和平臺(tái)的開發(fā)，腫瘤細(xì)胞液體活檢技術(shù)逐步用于臨床，以提高轉(zhuǎn)移病灶的檢出率和治療成功率[3]。在液體活檢計(jì)數(shù)中，作為主要成分的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）可攜帶外周血液循環(huán)中活腫瘤細(xì)胞的生物信息，有助于轉(zhuǎn)移病灶的臨床治療。由于腫瘤患者外周血中CTC含量極低，臨床上如何提高CTC的富集效率仍具有較高的技術(shù)挑戰(zhàn)性[4-5]。上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）廣泛表達(dá)于多數(shù)上皮來(lái)源的惡性腫瘤，常作為富集CTC的主要標(biāo)志物[6-7]。雖然腫瘤生物標(biāo)志物在腫瘤細(xì)胞中具有較好的特異性，但由于富集過(guò)程中腫瘤細(xì)胞易丟失，導(dǎo)致CTC的富集效率較低。在CTC的陰性富集過(guò)程中，CD45+白細(xì)胞的去除是關(guān)鍵步驟，該步驟通過(guò)抗體結(jié)合和磁場(chǎng)分離電荷將白細(xì)胞從提取液中移除，留下帶有腫瘤細(xì)胞的溶液[8]。根據(jù)筆者前期CTC富集結(jié)果和實(shí)驗(yàn)操作，發(fā)現(xiàn)部分CD45-的腫瘤細(xì)胞被磁場(chǎng)中白細(xì)胞團(tuán)塊包繞并鎖定在試管壁上，同時(shí)與白細(xì)胞一起被移除，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的富集效率低下。為提高富集效率，筆者在實(shí)驗(yàn)中將本該與白細(xì)胞一起移除的試管進(jìn)行再次洗脫和磁場(chǎng)分選，從而將白細(xì)胞團(tuán)塊包繞的腫瘤細(xì)胞提取出來(lái)，以提高CTC的富集效率。為了驗(yàn)證假設(shè)，筆者將生長(zhǎng)良好的SW620細(xì)胞按照不同的細(xì)胞數(shù)量加入健康獻(xiàn)血者的血液以模擬CTC，采用設(shè)計(jì)的優(yōu)化方案富集腫瘤細(xì)胞，并與常規(guī)方案進(jìn)行比較，以評(píng)估優(yōu)化方案的富集效率。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與材料 SW620細(xì)胞為EpCAM+/CK+/CD45-人結(jié)腸癌細(xì)胞，購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。RBC裂解緩沖液（規(guī)格：10 ml，型號(hào)：Cat-20120）、CD45 混合物（規(guī)格：50 μl/ml，型號(hào)：Cat-18259）、免疫磁珠（規(guī)格：100 μl/ml，型號(hào)：Cat-18259）均購(gòu)自加拿大Stem Cell公司；EpCAM抗體（規(guī)格：20 μl，型號(hào)：347199）及其同型對(duì)照（規(guī)格：20 μl，型號(hào)：347221）、PE 偶聯(lián)的 CK 抗體（規(guī)格：20 μl，型號(hào)：347204）及其同型對(duì)照（規(guī)格：20 μl，型號(hào)：555574）均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 CTC模擬 將SW620細(xì)胞加入健康獻(xiàn)血者的血液中，以模擬CTC和患者血液。首先采集健康獻(xiàn)血者外周血約5 ml于肝素真空管中，室溫下儲(chǔ)存于恒溫培養(yǎng)箱中。同時(shí)將穩(wěn)定生長(zhǎng)的SW620細(xì)胞打散后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，使每1 ml PBS中含有50、75、100、150個(gè)SW620細(xì)胞。然后將5 ml健康獻(xiàn)血者血樣緩慢加入20 ml 1×RBC裂解緩沖液中，再加入一定量的SW620細(xì)胞（50、75、100和150個(gè)細(xì)胞）。常規(guī)孵育和離心后，去除裂解的紅細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液（白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞），計(jì)數(shù)細(xì)胞后進(jìn)一步去除CD45+白細(xì)胞。

1.3 富集方案 （1）常規(guī)方案：使用人CD45去除試劑盒（包括CD45混合物和免疫磁珠結(jié)合白細(xì)胞）[9]。將帶有細(xì)胞懸液的試管放入磁鐵中，CD45+白細(xì)胞在磁場(chǎng)作用下可貼于試管壁，細(xì)胞懸液中剩下CD45-腫瘤細(xì)胞；將含CD45-腫瘤細(xì)胞的上清液移入流式細(xì)胞管中，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行腫瘤細(xì)胞分選和細(xì)胞計(jì)數(shù)。（2）優(yōu)化方案：對(duì)含有貼壁CD45+白細(xì)胞的試管重新進(jìn)行沖洗和磁場(chǎng)作用，以洗脫被白細(xì)胞包繞和貼壁的腫瘤細(xì)胞，對(duì)其重新進(jìn)行富集，見圖1。

圖1 常規(guī)方案和優(yōu)化方案（第2次免疫磁珠陰性富集）進(jìn)行CTC富集圖示（CTC為循環(huán)腫瘤細(xì)胞）

1.4 常規(guī)方案正常劑量與高劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細(xì)胞效率驗(yàn)證 去除白細(xì)胞時(shí)，分別加入正常劑量的 CD45混合物（50 μl/ml）+免疫磁珠（100 μl/ml）、高劑量的 CD45 混合物（62.5 μl/ml）+免疫磁珠（125 μl/ml），對(duì) CD45+白細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合和分離，以驗(yàn)證CD45混合物和免疫磁珠是否可以通過(guò)結(jié)合更多的白細(xì)胞和包繞更多的CD45-腫瘤細(xì)胞來(lái)降低腫瘤細(xì)胞富集效率的假設(shè)。

1.5 SW620細(xì)胞富集效率檢測(cè) 采用EpCAM和CK雙抗體染色、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分選和計(jì)數(shù)。去除CD45+白細(xì)胞后，使用EpCAM抗體及其同型對(duì)照進(jìn)行表面細(xì)胞膜染色，然后使用PE偶聯(lián)的CK抗體15 μl進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色；取細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分選和計(jì)數(shù)。SW620細(xì)胞富集效率=富集細(xì)胞個(gè)數(shù)/加入的SW620細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)方案正常劑量與高劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細(xì)胞效率比較 在常規(guī)方案中，正常劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細(xì)胞的平均效率為65.5%，高于高劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細(xì)胞的平均效率58.3%，見表1。這證實(shí)CD45混合物和免疫磁珠可以通過(guò)結(jié)合更多的白細(xì)胞和包繞更多的CD45-腫瘤細(xì)胞來(lái)降低腫瘤細(xì)胞富集效率。

表1 正常劑量與高劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細(xì)胞效率比較[個(gè)（%）]

2.2 常規(guī)方案與優(yōu)化方案富集SW620細(xì)胞效率比較 采用優(yōu)化方案富集SW620細(xì)胞的平均效率為82.8%，高于常規(guī)方案富集SW620細(xì)胞的平均效率61.9%，見表2和圖2（插頁(yè)）。

圖2 常規(guī)方案與優(yōu)化方案對(duì)150個(gè)SW620細(xì)胞富集效率的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（a-c：采用常規(guī)方案，分別顯示總細(xì)胞、CD45-細(xì)胞、CK+EpCAM+細(xì)胞數(shù)目為 287 535、21 815、91個(gè)；d-f：采用優(yōu)化方案，分別顯示總細(xì)胞、CD45-細(xì)胞、CK+EpCAM+細(xì)胞數(shù)目為 718 072、60 208、35個(gè)；CK為細(xì)胞角蛋白；EpCAM為上皮細(xì)胞黏附分子）

表2 常規(guī)方案與優(yōu)化方案富集SW620細(xì)胞效率比較[個(gè)（%）]

3 討論

CRC是一種常見的消化道惡性腫瘤，疾病相關(guān)死亡率與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。CTC是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途經(jīng)和步驟，但CTC的精準(zhǔn)分選和有效富集是CTC檢測(cè)的重要障礙，主要原因是缺乏特異性的CTC生物標(biāo)志物以及CTC富集過(guò)程中腫瘤細(xì)胞的丟失[10]。CTC富集的典型過(guò)程包括紅細(xì)胞溶解、白細(xì)胞去除（陰性篩選）和CTC捕獲（陽(yáng)性選擇）[11]。為了更好地分離和鑒定CTC，需要用CD45去除白細(xì)胞，然后采用熒光抗體染色方法從血液樣本中捕獲CTC，上皮性腫瘤標(biāo)志物（EpCAM、CK）因其在腫瘤細(xì)胞表達(dá)但在白細(xì)胞中表達(dá)缺失而被用于CTC的捕獲[12]。EpCAM、CK在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在白細(xì)胞中不表達(dá)，因此常用于CTC的富集和捕獲[13]。CTC陽(yáng)性富集容易丟失部分有價(jià)值但不表達(dá)上皮性腫瘤標(biāo)志物的CTC，而CTC陰性富集可以通過(guò)去除CD45+白細(xì)胞而富集CD45-的CTC，將不表達(dá)上皮性腫瘤標(biāo)志物的CTC加以富集，從而提高CTC的富集效率[14]。CTC陰性富集也有不足，即在去除CD45+白細(xì)胞的操作步驟中易丟失部分CTC，導(dǎo)致CTC富集效率不高。因此，本文從CTC陰性富集過(guò)程中的CTC丟失入手，通過(guò)優(yōu)化CTC富集流程，以提高CTC富集效率。

在多個(gè)CTC富集步驟中，白細(xì)胞去除是可以優(yōu)化的步驟，因?yàn)閿?shù)百萬(wàn)個(gè)CD45+白細(xì)胞在磁場(chǎng)作用下貼附于試管壁，這同時(shí)也會(huì)將部分腫瘤細(xì)胞加以包繞和貼附，使這些腫瘤細(xì)胞與CD45+白細(xì)胞一起被移除，導(dǎo)致其無(wú)法進(jìn)入下一步的細(xì)胞分選和計(jì)數(shù)過(guò)程[15]。因此，筆者認(rèn)為對(duì)此步驟加以優(yōu)化，可以有效提高CTC的富集效率。首先，本研究比較了正常劑量與高劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細(xì)胞的效率，兩組按正常CTC富集方案進(jìn)行CD45+白細(xì)胞的移除，然后對(duì)附在試管壁的白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞用PBS進(jìn)行洗脫和第二輪CD45+白細(xì)胞移除，結(jié)果顯示正常劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細(xì)胞的平均效率（65.5%）高于高劑量組（58.3%），提示高劑量CD45混合物和免疫磁珠在CD45+白細(xì)胞移除階段可以包繞更多的腫瘤細(xì)胞，使CTC富集數(shù)量減少。這驗(yàn)證了筆者的假設(shè)：在CD45+白細(xì)胞移除步驟中，腫瘤細(xì)胞被貼壁的白細(xì)胞固定于試管壁，被當(dāng)作陰性對(duì)照導(dǎo)致丟失，使得陰性篩選的富集效率不高。因此本研究?jī)?yōu)化富集方案，對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行洗脫和重新富集，結(jié)果顯示優(yōu)化方案富集SW620細(xì)胞的平均效率（82.8%）高于常規(guī)方案（61.9%）。

綜上所述，優(yōu)化CD45免疫磁珠陰性篩選法（對(duì)含有貼壁CD45+白細(xì)胞的試管再次洗脫和磁場(chǎng)分選）能提高CTC富集效率，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。但今后仍需精準(zhǔn)的、大樣本的臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，使富集CTC的實(shí)驗(yàn)方案更加完善。