肉桂葉精油/β-環(huán)糊精微膠囊的制備及緩釋特性

李國良， 劉香萍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院；黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室,黑龍江 大慶 163319)

樟科植物肉桂被廣泛用作香料，并在香水、調(diào)味品和制藥等行業(yè)中有許多應(yīng)用[1-2]。肉桂葉精油常被用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的芳香療法中，具有醒腦提神、殺菌、抗病毒以及風(fēng)濕病治療的效果。然而，肉桂葉精油具有強揮發(fā)性，使用不耐久，因此，具有緩釋效果的精油產(chǎn)品的市場需求越來越高。微膠囊技術(shù)是指利用天然的或者是合成的高分子材料作為壁材，將不同形態(tài)的芯材包埋，形成一種密封或半密封物質(zhì)的技術(shù)[3]。經(jīng)過包埋后的物料因形成了顆?；蛘叻勰┑裙腆w形態(tài)增加了運輸?shù)谋憷裕惨蚱鋬?yōu)良的散落性可以與其他物料或者配料混合使用提高了使用效率。精油微膠囊的制備不僅使精油的芳香成分得以保留，還能有效控制精油活性成分的緩慢釋放，從而大大提高其商業(yè)價值[4]。β-環(huán)糊精是制備微膠囊常用的壁材，制備方法有很多，主要有超聲波法、研磨法、噴霧干燥法、共沉淀法等。超聲波法是將芯材加入到壁材的飽和溶液中，在超聲波的作用下使得壁材包裹芯材，再經(jīng)過降溫、抽濾、洗滌、烘干、粉碎形成微膠囊，但操作復(fù)雜，耗時長[5]。研磨法是將β-環(huán)糊精加入水中研磨，再加入已經(jīng)溶于溶劑中的芯材溶液充分研磨成糊狀，通過低溫干燥、洗滌、再干燥即獲得包埋物，但制備量少且耗時耗力[6]。噴霧干燥法是食品工業(yè)中普遍使用的包埋方法，一般需要乳化、均質(zhì)和霧化等步驟，但需要專業(yè)的霧化儀器，且對操作人員的專業(yè)要求較高[7]。共沉淀法則是將β-環(huán)糊精溶液與芯材混合在熱狀態(tài)下進(jìn)行攪拌，冷卻之后可形成沉淀物再經(jīng)過抽濾、凍干即可獲得目標(biāo)物的微膠囊，操作簡單，包埋物的精油保留率高[8]。本研究以β-環(huán)糊精為壁材、肉桂葉精油為芯材，使用共沉淀法制備了肉桂葉精油/β-環(huán)糊精微膠囊，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)結(jié)合傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)對微膠囊進(jìn)行了表征，以期將其進(jìn)一步用作果蔬保鮮劑、飼料添加劑等，為肉桂葉精油在食品、飼料等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

肉桂葉，2018年8月購自廣西紫桂堂生物科技有限公司，經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)楊磊教授鑒定為肉桂(CinnamomumcassiaPresl)葉，自然風(fēng)干后粉碎過篩置于干燥器中低溫(8±4) ℃儲存。β-環(huán)糊精、無水乙醇，均為市售分析純；去離子水，實驗室自制。

Magna-IR560 E.S.P傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；6890N/5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀，美國安捷倫公司。

1.2 肉桂葉精油的提取

1.3 肉桂葉精油組分分析

采用GC-MS分析肉桂葉精油組分，色譜柱為DB-17MS型毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，蒸發(fā)室溫度270 ℃，以氦作為載氣；進(jìn)樣量1.0 μL，流速1.0 mL/min；柱溫在100 ℃保持4 min，然后以5 ℃/min 的升溫速率升高到230 ℃，保持5 min；檢測器溫度保持在280 ℃。離子源(EI)溫度為230 ℃，電子能為70 eV，掃描范圍15～500 u；樣品峰通過與NIST02質(zhì)譜庫中對比定性，每種精油成分的量(以相對峰面積表示)通過峰歸一化得到[9]。

1.4 肉桂葉精油微膠囊制備

1.4.1肉桂葉精油標(biāo)準(zhǔn)曲線 用無水乙醇配置10 mg/L的肉桂葉精油溶液，在紫外分光光度計上進(jìn)行全波長掃描，以無水乙醇為空白調(diào)零，最大吸光度值對應(yīng)的波長即為肉桂葉精油的最大吸收波長。然后準(zhǔn)確配置1、 5、 10、 15、 20、 25 mg/L的肉桂葉精油乙醇溶液，在其最大吸收波長處測定吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)測定，最大吸收波長為285 nm，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.093 3x-0.023 5,R2=0.999 2，精油質(zhì)量濃度和吸光度之間線性擬合良好。

1.4.2單因素試驗 用沉淀法[10]制備肉桂葉精油/β-環(huán)糊精微膠囊。在一定溫度下磁力攪拌，將一定量β-環(huán)糊精溶解在適量的乙醇/水(體積比為1 ∶2)混合物中，制備成飽和的環(huán)糊精乙醇水混合液。將肉桂葉精油按體積比1 ∶20溶于無水乙醇，然后緩慢加入β-環(huán)糊精溶液，壁芯比按質(zhì)量比分別設(shè)為3 ∶1、 6 ∶1、 9 ∶1、 12 ∶1、 15 ∶1，保持加熱，溫度分別設(shè)置為30、 40、 50、 60、 70 ℃，攪拌時間分別為1、 3、 5、 7、 9 h，攪拌速度分別設(shè)置為400、 800、 1 000、 1 200、 1 400 r/min，進(jìn)行包埋。包埋后真空泵抽濾，所得固形物冷凍干燥，即為肉桂精油/β-環(huán)糊精微膠囊，常溫避光保存。

分別取0.1 g肉桂葉精油微膠囊粉末2份，一份用10 mL無水乙醇分散后在25 ℃條件下，500 W超聲波處理30 min，使膠囊壁材破碎，精油溶于無水乙醇中，過濾后將濾液用無水乙醇補足10 mL；另一份用10 mL無水乙醇快速洗滌，洗滌液過濾后用無水乙醇補足至10 mL。兩份溶液分別測定吸光度，根據(jù)肉桂葉精油標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算油含量，分別為微膠囊總油質(zhì)量濃度(C1，mg/L)及微膠囊表面油質(zhì)量濃度(C2,mg/L)。按照如下公式計算精油包埋率(I,%)：

在各階段曲塊中，共計發(fā)現(xiàn)291個分類操作單元（OTU），具多樣性（圖3A）；OTU數(shù)量在不同階段曲塊中，具明顯差異（圖3B）：與新入庫曲塊（T0）相比，在第1次（T1）和第2次翻曲（T2）時，曲塊細(xì)菌OTU數(shù)量有顯著增加；在第3次翻曲（T3）時，OTU數(shù)量急劇下降；在新制成品曲（T4）和儲藏3月的成品曲塊（T5）中，OTU數(shù)目趨于穩(wěn)定。

1.4.3正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取壁芯比(6 ∶1、 9 ∶1、 12 ∶1)、包埋溫度(40、 50、 60 ℃)、包埋時間(3、 4、 5 h)和攪拌速度(700、 1 000、 1 300 r/min)為主要影響因素，利用DPS V8.01軟件，以微膠囊包埋率為考察指標(biāo)，按L9(34)設(shè)計正交試驗，確定最佳制備工藝。

1.5 肉桂葉精油微膠囊分析表征

1.5.1組成分析 肉桂葉精油微膠囊中的成分采用溶劑萃取法測定。取100 mg的肉桂葉精油/β-環(huán)糊精微膠囊溶解在8 mL的去離子水中，隨后加入4 mL的正己烷，混合物置于具塞的耐壓管中，(85±2) ℃條件下水浴加熱15 min并輕微振搖，然后將混合物冷卻到室溫。收集含有精油的正己烷相，水相用正己烷(4 mL)連續(xù)萃取2次，正己烷相用無水硫酸鈉干燥，GC-MS分析。

1.5.2熱穩(wěn)定性及緩釋性分析 10 mg的肉桂葉精油樣品和111 mg的肉桂葉精油/β-環(huán)糊精微膠囊(相當(dāng)于10 mg的肉桂葉精油)，在45 ℃、 250 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌反應(yīng)0、 15、 30、 60、 120 min。收集0.5 mL 含有肉桂葉精油組分的飽和蒸氣，按1.4.2節(jié)中的方法測定精油含量。在分析結(jié)束時，中斷對微膠囊的加熱，按照1.4.2節(jié)中的方法提取微膠囊中剩余的肉桂葉精油并測定精油含量。

1.5.3FT-IR表征 向2 mg樣品中加入200 mg KBr進(jìn)行壓片，在4000～500 cm-1范圍內(nèi)掃描，獲得肉桂葉精油、β-環(huán)糊精和肉桂葉精油/β-環(huán)糊精微膠囊的FT-IR譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 肉桂葉精油組分分析

肉桂葉精油的組分采用GC-MS進(jìn)行分析。根據(jù)總離子流色譜各峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖對各組分進(jìn)行定性分析，并根據(jù)色譜峰的峰面積，用面積歸一化法來計算各組分的含量，結(jié)果見表1。共鑒定出26種組分，占精油總成分的96.52%，檢測出肉桂葉精油的主要成分是反式肉桂醛(81.39%)和鄰甲氧基肉桂醛(7.61%)。

表1 肉桂葉精油成分

續(xù)表1

肉桂葉精油化學(xué)組成和生物活性的變化已被廣泛研究，精油的定性和定量組成被認(rèn)為是可變的，除了生物氣候條件，干燥、提取和分析方法外，還受物種固有的因素影響，例如植物的營養(yǎng)階段和植物的不同部位[11]。在此次研究中將肉桂葉精油主要化學(xué)成分與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，可以觀察到這些化合物具有相似性，但有不同的豐量[12]。

2.2 肉桂葉精油微膠囊制備的單因素試驗

壁芯比值、包埋溫度、包埋時間和攪拌速度對包埋率影響的單因素試驗結(jié)果見圖1。圖1(a)為攪拌速度1 000 r/min，包埋時間5 h，包埋溫度50 ℃條件下，不同壁芯質(zhì)量比值下肉桂葉精油微膠囊的包埋率。由圖1(a)可以看出，壁芯比值對微膠囊的精油包埋率影響較大，精油包埋率在壁芯比值為6和9時均能達(dá)到70%以上，分別為71.5%和74.66%。壁芯比值過小(3)時，肉桂葉精油未被β-環(huán)糊精包埋，包埋率較低；壁芯比值過大(12和15)時，包埋率亦較低，這是由于壁材β-環(huán)糊精用量過大，壁材與芯材比例失衡。因此，優(yōu)選壁芯比值為9。

a.壁芯比wall-core ratio； b.包埋溫度encapsulation temperature； c.包埋時間encapsulation time； d.攪拌速度agitation rate

在壁芯比值為9，攪拌速度1 000 r/min，包埋時間5 h的條件下，調(diào)節(jié)包埋溫度為30、 40、 50、 60和70 ℃，研究不同包埋溫度對肉桂葉精油微膠囊包埋率的影響，結(jié)果見圖1(b)。從圖中可以看出，隨溫度升高精油微膠囊包埋率呈先升高后降低趨勢。當(dāng)體系溫度增加至50 ℃，包埋率達(dá)到最高值(71.4%)，之后隨著溫度的增加，包埋率顯著下降。分析其原因，溫度過低β-環(huán)糊精溶解度較小，固態(tài)分子難以與精油形成微膠囊，所以升溫有利于提高包埋效果；但溫度超過50 ℃，會造成揮發(fā)油損失，不利于包埋物的形成。因此，選取50 ℃作為最佳包埋溫度。

在壁芯比值為9，攪拌速度1 000 r/min，包埋溫度50 ℃的條件下，改變包埋時間(1、 3、 5、 7、 9 h)，精油微膠囊包埋率變化見圖1(c)。肉桂葉精油包埋率隨著包埋時間延長先增加，在5 h時達(dá)到最大(72.1%)，隨后隨包埋時間延長其包埋率顯著降低。推測原因可能是由于包埋時間短，肉桂葉精油難以被壁材β-環(huán)糊精包覆，但過長的攪拌時間，不可避免造成芯材肉桂葉精油的揮發(fā)。因此，肉桂葉精油微膠囊制備的最佳包埋時間為5 h。

在壁芯比值為9，包埋溫度為50 ℃，包埋時間5 h的條件下，調(diào)節(jié)攪拌速度為400、 800、 1 000、1 200 和1 400 r/min，研究不同攪拌速度對肉桂葉精油包埋率的影響，結(jié)果如圖1(d)所示。隨著攪拌速度的增加，肉桂葉精油微膠囊包埋率先呈逐漸升高趨勢，在1 000 r/min攪拌速度下微膠囊包埋率達(dá)最大值(70.9%)，隨后隨攪拌速度的增加包埋率逐漸降低。因為當(dāng)攪拌速度較低時，芯材肉桂葉精油和壁材β-環(huán)糊精的分散性差，不利于微膠囊的形成；攪拌速度過高時，精油的揮發(fā)量增加，同時β-環(huán)糊精也易分解，肉桂葉精油包埋率會降低。因此，選取攪拌速度1 000 r/min。

2.3 肉桂葉精油微膠囊制備條件的正交試驗優(yōu)化

采用L9(34)正交試驗設(shè)計，針對壁芯比、包埋溫度、包埋時間和攪拌速度4個影響因素優(yōu)化微膠囊制備條件，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 精油微膠囊制備的正交試驗結(jié)果

表3 包埋率方差分析

由表2可知，各因素對微膠囊包埋率影響的大小次序依次為：A(壁芯比)>B(包埋溫度)>D(攪拌速度)>C(包埋時間)。最佳包埋條件為：A1B2C2D2，即優(yōu)化后條件為壁芯比6 ∶1，包埋溫度50 ℃，包埋時間4 h，攪拌速度1 000 r/min。由方差分析結(jié)果可知，壁芯比影響顯著，其余各因素均對包埋率無顯著影響。經(jīng)驗證實驗(3次重復(fù)實驗)，在最優(yōu)條件下，精油微膠囊包埋率為74.17%。

2.4 肉桂葉精油微膠囊成分分析

最優(yōu)包埋條件制備的肉桂葉精油/β環(huán)糊精微膠囊與肉桂葉精油相比，微膠囊主要由反式肉桂醛(78.68%)和鄰甲氧基肉桂醛(9.34%)組成，與肉桂葉精油的主要組分反式肉桂醛(81.39%)和鄰甲氧基肉桂醛(7.61%)含量差異不大。反式肉桂醛的相對分子質(zhì)量132，鄰甲氧基肉桂醛的相對分子質(zhì)量162，相對分子質(zhì)量介于132和162之間的化合物由于與β-環(huán)糊精內(nèi)部空腔的相容性可以與β-環(huán)糊精絡(luò)合[13]。主要成分之間的相似性可能是由于β-環(huán)糊精腔的幾何相容性，以及調(diào)節(jié)包合過程中芯材分子的形狀和大小[14]，因為β-環(huán)糊精的外表面具有游離羥基，具有親水性，而內(nèi)部空腔基本上由葡萄糖分子與糖苷鍵連接而成，因此具有疏水性[15]。有報道提到與α-環(huán)糊精相比，β-環(huán)糊精的絡(luò)合效率更高[16]。

2.5 肉桂葉精油微膠囊熱穩(wěn)定性及緩釋性能分析

環(huán)糊精包合具有多個優(yōu)勢，例如，物理化學(xué)穩(wěn)定性提高、緩釋性提高、生物利用度提高[17]。這是因為環(huán)糊精包合會阻礙微膠囊中精油組分的快速揮發(fā)，達(dá)到緩釋效果[18]。

在圖2中觀察到肉桂精油在45 ℃下精油保留率隨時間推移快速下降，在80 min時精油保留率即達(dá)到0%，而肉桂葉精油/β-環(huán)糊精微膠囊的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于肉桂葉精油，微膠囊的精油保留率隨時間推移緩慢降低，在80 min時仍為80%。微膠囊中的肉桂葉精油由于β-環(huán)糊精的包覆，揮發(fā)性降低，增加了肉桂葉精油的熱穩(wěn)定性及緩釋性能。

2.6 紅外光吸收譜分析

圖3為β-環(huán)糊精、肉桂葉精油及肉桂葉精油/β-環(huán)糊精微膠囊的紅外光譜。

3 結(jié) 論

以β-環(huán)糊精為壁材、肉桂葉精油為芯材，使用共沉淀法制備了肉桂葉精油/β-環(huán)糊精微膠囊。通過單因素和正交試驗分析，得到制備微膠囊最佳條件為：壁芯比6 ∶1、包埋溫度50 ℃、包埋時間4 h、攪拌速度1 000 r/min，此工藝制備的微膠囊包埋率達(dá)74.17%。GC-MS結(jié)合FT-IR對制備的肉桂葉精油/β-環(huán)糊精微膠囊進(jìn)行表征，表明制備的微膠囊中的精油與肉桂葉精油具有相同的主要成分，即反式肉桂醛(78.68%)和鄰甲氧基肉桂醛(9.34%)。FT-IR分析表明肉桂葉精油與β-環(huán)糊精形成較好的包合物結(jié)構(gòu)。熱穩(wěn)定性及緩釋性能分析表明制備的肉桂葉精油/β-環(huán)糊精微膠囊具有良好的熱穩(wěn)定性及緩釋性能，45 ℃、 80 min時微膠囊中精油保留率仍有80%。