兩種柑橘類精油及其主要成分的抑菌和抗氧化活性

陳華錚， 朱 凱

(南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

柑橘是蕓香科柑橘屬植物的總稱，包括甜橙(Citrussinensis(L.) Osbeck)、紅橘(CitrusreticulataBlanco)等。我國柑橘的產(chǎn)量和銷量都居于世界首位，柑橘也是我國每年出口量最大的幾種水果之一[1]，同時(shí)，它也是一種很重要的芳香資源[2]。柑橘的果肉可用于制造果汁，但果皮往往會被直接扔掉，這樣不僅會危害環(huán)境，也會造成資源的浪費(fèi)[3]。柑橘皮富含植物精油，精油的主要成分為檸檬烯。檸檬烯是一種天然的單萜烯，具有一定的抗菌、消炎功效[4]。柑橘精油及檸檬烯通常具有廣譜的生物活性，因此受到廣大科研工作者的關(guān)注[5-6]。吳均等[7]采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除法、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉- 6-磺酸)二銨鹽自由基(ABTS·)清除法和鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)法來評估甜橙精油的體外抗氧化活性，結(jié)果表明：甜橙精油對DPPH·和ABTS+·有明顯的清除作用。Matías等[8]發(fā)現(xiàn)葡萄柚和檸檬精油對所有測試細(xì)菌均表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗微生物活性，其中對大腸桿菌的抑制效果最好。舒慧珍等[9]通過測試最小抑菌濃度(MIC)和生長曲線來研究檸檬烯對熒光假單胞菌生長的影響，結(jié)果表明：檸檬烯對熒光假單胞菌具有較好的抑菌效果,MIC值為20 mL/L。但以往的研究，通常只針對某一目標(biāo)物，并只限于抗氧化或抑菌，研究不夠全面深入。本研究通過對各類自由基的清除能力和總抗氧化能力，以及對一些常見菌種的抑制活性的探討，確定甜橙精油、紅橘精油及檸檬烯抑菌和抗氧化的能力，以期為柑橘類精油在食品、化妝品和保健品中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紅橘精油(蒎烯2.11%、月桂烯6.41%、γ-松油烯1.30%、檸檬烯86.53%)、甜橙精油(蒎烯1.02%、月桂烯3.58%、檸檬烯92.60%)、檸檬烯，購于江蘇豐澤土畜產(chǎn)品有限公司。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉- 6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、丁基羥基茴香醚(BHA，純度98%)，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)，南京林業(yè)大學(xué)生物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供。秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)野生N2型，南京野生植物綜合利用研究院提供。

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SPH-1102C回轉(zhuǎn)式振動恒溫培養(yǎng)箱，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 精油體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.1ABTS自由基清除率 參考吳均等[7]的方法，將7 mmol/L ABTS水溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液按體積比1 ∶1混合得ABTS工作液，于暗室中放置12～16 h。使用前，用無水乙醇進(jìn)行稀釋，調(diào)節(jié)其在734 nm處的吸光度為0.700±0.002。配置8 g/L的精油乙醇溶液，并使用二倍稀釋法，得到質(zhì)量濃度為8、 4、 2、 1和0.5 g/L的一系列精油乙醇溶液。將精油乙醇溶液與ABTS工作液按體積比1 ∶1 混合，避光反應(yīng)6 min后，使用紫外分光光度計(jì)在734 nm處讀取吸光度。乙醇為空白對照，BHA為陽性對照，配置8、 4、 2、 1和0.5 mg/L一系列工作溶液，并按上述方法測吸光度。ABTS自由基(ABTS+·)清除率計(jì)算公式為：RABTS+·=(1-(Ai-Aj)/A0)×100%。其中，RABTS+·為ABTS+·清除率(%)；Ai為樣品與ABTS工作液混合避光反應(yīng)后的吸光度；Aj為樣品與乙醇混合避光反應(yīng)后的吸光度；A0為乙醇與ABTS工作液混合避光反應(yīng)后的吸光度。

1.2.3超氧陰離子清除率 參考許雅娟等[12]的方法，對鄰苯三酚自氧化速率進(jìn)行測定。空白管中加入4.5 mL的50 mmol/L pH值8.2的Tris-HCl緩沖溶液、 4.2 mL的H2O和0.3 mL的10 mmol/L HCl；樣品管中加入4.5 mL的Tris-HCl緩沖溶液(50 mmol/L，pH值8.2，下同)、 4.2 mL的H2O和0.3 mL的5 mmol/L 鄰苯三酚(25 ℃預(yù)熱)，搖勻后，立即置于波長325 nm處測量吸光度，每30 s測一次，連續(xù)測量10次，計(jì)算鄰苯三酚在弱堿條件下的平均自氧化速率。

1.2.4總抗氧化能力 參考夏穎等[13]的方法，采用鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)分析法測定精油的總抗氧化能力。配制10、 25、 50、 100、 250、 500 μmol/L的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，量取醋酸鈉緩沖溶液(0.3 mol/L，pH值3.6，下同)、TPTZ溶液(10 mmol/L)以及FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液按體積比10 ∶1 ∶1混合，在37 ℃ 下反應(yīng)30 min，于593 nm處測定混合溶液的吸光度。以FeSO4溶液濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得：y=408.77x+12.478(R2=0.998)。

將醋酸鈉緩沖溶液、TPTZ溶液(10 mmol/L)和20 mmol/L FeCl3溶液按體積比10 ∶1 ∶1混合，得到TPTZ工作液。配置0.08 g/L的精油乙醇溶液，并使用二倍稀釋法，得到質(zhì)量濃度為0.08、 0.04、 0.02、 0.01和0.005 g/L的一系列精油乙醇溶液。量取0.2 mL精油乙醇溶液加入到3.8 mL TPTZ工作液中，混合均勻。在37 ℃下反應(yīng)30 min后，在593 nm處測定溶液的吸光度，依據(jù)FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各溶液的總抗氧化活性。

1.3 精油體內(nèi)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

通過對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性的影響來評定精油和檸檬烯的體內(nèi)抗氧化效力[14]。人體內(nèi)的H2O2具有高氧化能力以及很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，CAT能在細(xì)胞中促進(jìn)過氧化氫分解，使其不會進(jìn)一步產(chǎn)生毒性更大的氫氧自由基，從而保護(hù)抗氧化酶系統(tǒng)的功能作用，對于人體的生長發(fā)育和代謝活動亦具有重要意義。將秀麗線蟲培養(yǎng)至產(chǎn)卵期，且體內(nèi)含有大量卵時(shí)，用M9緩沖溶液洗脫并轉(zhuǎn)移至離心管中，而后在離心管中清洗3次，加入線蟲裂解液，5 000 r/min離心1 min，離心結(jié)束后去除上層清液，再次用M9緩沖溶液反復(fù)清洗3次。將剩余的沉淀物重新涂布于含有大腸桿菌OP50的新鮮線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)上，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48至60 h，得新一批年輕的L4期成蟲。將同步化后得到的L4期秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移至新的含有大腸桿菌OP50的NGM中，空白對照組加入2% DMSO水溶液，處理組分別加入用2% DMSO水溶液配置的10和100 mg/L的不同濃度精油溶液。將處理過的線蟲置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)72 h，使用CAT測試盒測酶活性，實(shí)驗(yàn)步驟參考測試盒說明書。

1.4 精油抑菌活性實(shí)驗(yàn)

1.4.1培養(yǎng)基的配制 稱取氯化鈉0.5 g、酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1 g溶解于100 mL去離子水中，配好的培養(yǎng)基封口后置于高溫滅菌鍋中，于120 ℃、 0.1 MPa下滅菌30 min后，即可得LB液體培養(yǎng)基。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5 g瓊脂，別的操作同LB液體培養(yǎng)基。

1.4.2菌種活化 在超凈工作臺中，分別將4種供試菌種接種到裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，置于37 ℃搖床中120 r/min培養(yǎng)24 h，采用10倍稀釋法，以無菌生理鹽水稀釋菌液至濃度約為106～107CFU/mL，備用。

1.4.3精油抑菌圈直徑的測試 在超凈工作臺中，移取100 μL活化后的菌液，加入到100 mL 60～70 ℃的LB固體培養(yǎng)基中，搖勻，然后等量倒入一次性塑料培養(yǎng)皿中，風(fēng)干。分別移取5 μL體積分?jǐn)?shù)10%、 20%、 40%和80%的精油丙酮溶液滴加在6 mm的濾紙片上，將濾紙片貼于LB固體培養(yǎng)基上(丙酮為空白對照)；蓋上蓋子并用封口膜密封，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用十字測量法測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜橙油、紅橘油和檸檬烯的抗氧化活性比較

2.1.1ABTS+·清除率 從表1可以看出，甜橙油、紅橘油和檸檬烯對ABTS+·都有一定的清除能力。從清除率達(dá)25%時(shí)的質(zhì)量濃度(IC25)來看，紅橘油對ABTS+·的清除效果最好，IC25為1.481 g/L，其次為檸檬烯、甜橙油，但都遠(yuǎn)大于BHA的0.001 g/L。經(jīng)分析可以發(fā)現(xiàn)甜橙油、紅橘油和檸檬烯對ABTS+·的清除能力并未與精油中檸檬烯的含量呈正比關(guān)系，由此推斷，較之于檸檬烯和甜橙油，可能是紅橘油中γ-松油烯的存在，影響了其抗氧化能力[15]。

表1 甜橙油、紅橘油和檸檬烯對ABTS+·和DPPH·的IC25

2.1.2DPPH·清除率 從表1可以看出，甜橙油、紅橘油和檸檬烯對DPPH·都有一定的清除能力。從IC25來看，紅橘油對DPPH·的清除效果最好，IC25為24.824 g/L；其次為甜橙油、檸檬烯，但都遠(yuǎn)大于BHA的0.006 g/L。同樣的紅橘油中γ-松油烯的存在，影響了其抗氧化能力，較之于檸檬烯和甜橙油，其對DPPH·的清除能力有所提高[16]。

2.1.4總抗氧化能力 從圖2可以看出，甜橙油、紅橘油、檸檬烯以及BHA的FRAP值隨著質(zhì)量濃度的升高而略微呈增大趨勢。

當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.005 g/L時(shí)，甜橙油、紅橘油、檸檬烯以及BHA的FRAP值都比較接近，在196～208 μmol/L之間；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.08 g/L時(shí)，BHA的FRAP值遠(yuǎn)高于檸檬烯、甜橙油和紅橘油，為604.79 μmol/L；檸檬烯、甜橙油和紅橘油的FRAP值依舊相近，其中檸檬烯最優(yōu)，為215.23 μmol/L。總體而言，檸檬烯、甜橙油和紅橘油具有較為不錯(cuò)的總抗氧化能力。

表2 過氧化氫酶活性值

2.1.5體內(nèi)抗氧化活性 從表2可以看出，在質(zhì)量濃度為10 mg/L 時(shí)，檸檬烯對CAT活性的提高效果最好，其次為紅橘油，甜橙油則無促進(jìn)作用；在100 mg/L時(shí)，紅橘油、甜橙油和檸檬烯都可以提高CAT的活性，其中檸檬烯的效果最好，由空白對照的28.20 U/mg提高到46.32 U/mg。紅橘油中有γ-松油烯的存在，其效果則略低于檸檬烯，CAT活性值為45.98 U/mg,紅橘油具有較好的體內(nèi)抗氧化活性，可有效提高過氧化氫酶的活性。

2.2 甜橙油、紅橘油和檸檬烯的抑菌活性比較

抑菌圈直徑越大表示抑菌活性越好，大于15 mm為高度敏感,9～15 mm為中度敏感,7～9 mm為低度敏感, 小于7 mm為不敏感[17-18]。從表3可以看出，在體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，甜橙油、紅橘油和檸檬烯對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果較優(yōu)，抑菌圈直徑為9～13 mm，屬于中度敏感；而對枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的抑菌圈直徑僅為7～9 mm，屬于低度敏感。總體來看，檸檬烯對于4種受試菌種的抑菌效果最好，其次就是紅橘油、甜橙油；通過研究其成分，發(fā)現(xiàn)紅橘油中的檸檬烯含量雖略低于甜橙油，可能因?yàn)棣?松油烯的存在導(dǎo)致紅橘油的抑菌效果要略好于甜橙油。

表3 甜橙油、紅橘油和檸檬烯的抑菌活性

3 結(jié) 論