小麥矮稈基因 Rht-B1b和 Rht-D1b的檢測及其驗證

劉 娟，張 凱，范勝男，韓 洋，馮玉梅，李星巖，韓 冰，楊 燕

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物技術(shù)功能實驗室/內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

小麥作為全球主要的糧食作物之一[1]，隨著全球人口數(shù)量不斷增加、氣候不斷惡化以及旱澇等自然災(zāi)害頻發(fā)，使得小麥產(chǎn)量大幅度下降。因此，高產(chǎn)成為小麥育種的主要目標(biāo)之一。株高作為谷類作物的重要農(nóng)藝性狀，對作物產(chǎn)量潛力和穩(wěn)定性具有重要影響。研究表明，降低株高可提高植物的抗倒伏性[2-3]。

上世紀(jì)60年代，矮稈基因首次應(yīng)用到小麥育種中，引發(fā)了第一次“綠色革命”[4]，在小麥育種實踐中利用的矮稈基因大體可分為三類：草叢型矮生基因(D)、單莖矮生基因(Us)[5-6]和降低株高的主效矮稈基因(Rht)。截止目前，已發(fā)現(xiàn)的小麥Rht矮稈基因共有25個，每個Rht基因?qū)π←溨旮弋a(chǎn)生的影響不同。其中，在小麥的矮化育種中，使用最廣泛的矮稈基因是來自于農(nóng)林10號的Rht-B1b(Rht1基因突變型)、Rht-D1b(Rht2基因突變型)和來自于日本赤小麥(Akakomugi)的Rht8[7-8]。Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8為隱性基因，分別位于小麥4B、4D和2D染色體上。研究發(fā)現(xiàn)，Rht-B1b和Rht-D1b基因單獨存在時，降稈效應(yīng)約24%，Rht-B1b和Rht-D1b同時存在時，會產(chǎn)生累加作用，降稈效應(yīng)近60%[9-10]。而Rht8降稈效應(yīng)為11%[11]，相較于Rht-B1b和Rht-D1b，降稈能力較弱[12]。

分子標(biāo)記的應(yīng)用，使得更多的基因被準(zhǔn)確定位，Ellis等[13]設(shè)計的STS分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確地鑒定出Rht-B1b和Rht-D1b基因。本研究利用Ellis等[13]設(shè)計的STS分子標(biāo)記引物對321份中國小麥材料Rht-B1b和Rht-D1b基因的分布情況進(jìn)行檢測，此外，對91份春小麥育種材料(具有株高表型數(shù)據(jù))中Rht-B1b、Rht-D1b以及Rht-B1b+Rht-D1b的分布及各單倍型對小麥株高的影響進(jìn)行分析，以期篩選出優(yōu)良的矮稈基因資源，為合理利用小麥資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料包括321份小麥材料，其中，中國冬麥區(qū)白粒小麥品種84份，中國小麥歷史品種106份，春小麥育種材料131份，均由本實驗室收集和保存。并選取91份春小麥育種材料(具有株高表型數(shù)據(jù))進(jìn)行春小麥自然群體的株高鑒定。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥基因組DNA提取

利用CTAB法[14]提取321份小麥幼嫩葉片的基因組DNA，利用紫外分光光度計檢測DNA濃度，并將終濃度調(diào)至50 ng·μL-1，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 矮稈基因的分子標(biāo)記檢測

根據(jù)Ellis等[13]發(fā)表的序列設(shè)計引物，引物對BF/WR1用于擴增Rht-B1a基因(Rht1基因野生型)，引物對BF/MR1用于擴增Rht-B1b基因(Rht1基因突變型)；引物對DF2/WR2用于擴增Rht-D1a(Rht2基因野生型)，引物對DF1/MR2用于擴增Rht-D1b(Rht2基因突變型)，分別以小偃 6 號(含有Rht-B1b基因)[15]和新麥18(含有Rht-D1b基因)[16]為陽性對照，驗證PCR反應(yīng)和電泳結(jié)果的準(zhǔn)確性。上述引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成，具體序列信息見表1。

PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括模板DNA 1 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 6.2 μL，引物(濃度為0.25 nmol·μL-1)各0.15 μL，滅菌雙蒸水補充至15 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s，退火溫度見表1，時間為 30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，用Gold View核酸染料染色，緩沖體系為1×TAE溶液，100 V電壓下電泳20 min，在凝膠成像儀下觀察并照相。

表1 擴增矮稈基因所用的特異引物Table 1 Specific primers for amplification of dwarfing genes

1.2.3 91份春小麥育種材料株高的測定

2015和2016年分別將91份春小麥育種材料播種于內(nèi)蒙古呼和浩特市，采用隨機區(qū)組設(shè)計，行長2 m，株距15 cm，行距20 cm，設(shè)置2個重復(fù)，在相同外界條件下進(jìn)行培養(yǎng)，小麥進(jìn)入成熟期后，每一株系隨機選取10個單株進(jìn)行株高測量，統(tǒng)計每份材料兩年的平均株高數(shù)據(jù)，求均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rht-B1基因位點等位變異的分布頻率

利用兩對引物BF/MR1和BF/WR1對供試材料Rht-B1基因位點進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果(圖1，表2～4)顯示，在321份材料中，中國春、河套3號等66份材料含有矮稈基因Rht-B1a，占總數(shù)的20.1%；82170-1、臨優(yōu)一號等193份小麥品種含有矮稈基因Rht-B1b，占總數(shù)的 60.1%；巴豐5號、蘭天25號等62份材料不含所檢測矮稈基因，占總數(shù)的19.3%。

在84份中國冬麥區(qū)白粒小麥品種中，含有Rht-B1a、Rht-B1b以及不含所檢測矮稈基因的材料分別有30、29和25份，占比分別為35.7%、34.5%和29.8%。在106份歷史小麥品種中，含有Rht-B1a、Rht-B1b以及不含所檢測矮稈基因材料分別有8、77和21份，占比分別為7.6%、72.6%和19.8%。在131份春小麥育種材料中，含有Rht-B1a、Rht-B1b以及不含所檢測矮稈基因的材料分別有28、87和16份，占比分別為 21.4%、66.4%和12.2%。

2.2 Rht-D1基因位點等位變異的分布頻率

對供試小麥品種Rht-D1基因位點進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果(圖2，表2～4)顯示，321份材料中，永2352、臨農(nóng)14等73份小麥品種含有矮稈基因Rht-D1a，占總數(shù)的22.7%；臨優(yōu)一號、格蘭尼等135份小麥品種矮稈基因Rht-D1b，占總數(shù)的42.1%；沈太1號、陜農(nóng)757等113份小麥品種均不含所檢測矮稈基因，占總數(shù)的35.2%。

表2 84份中國冬麥區(qū)白粒小麥品種矮稈基因的檢測Table 2 Detection result of dwarfing genes in 84 wheat cultivars in China winter wheat areas

+代表有該材料含有所檢測的矮稈基因；-代表該材料不含所檢測的矮稈基因。表3～4同。

+ means containing the dwarfing genes detected;-means not containing dwarfing genes detected.The same in tables 3-4.

表3 106份中國歷史小麥品種矮稈基因的檢測結(jié)果Table 3 Detection result of dwarfing genes in 106 historical wheat cultivars

表4 131份春小麥材料矮稈基因的檢測結(jié)果Table 4 Detection result of dwarfing genes in 131 spring wheat breeding materials

(續(xù)表4 Continued table 4)

在84份中國冬麥區(qū)白粒小麥品種中，含有Rht-D1a、Rht-D1b以及不含所檢測矮稈基因的材料分別有14、41和29份，占比分別為16.7%、48.8%和34.5%。在106份歷史小麥品種中，含有Rht-D1a、Rht-D1b以及不含Rht-D1a和Rht-D1b矮稈基因的材料分別有40、21和45份，占比分別為37.7%、19.8%和42.5%。在131份春小麥育種材料中，含有Rht-D1a、Rht-D1b以及不含所檢測矮稈基因的材料分別有19、73和39份，占比分別為14.5%、55.7%和29.8%。

2.3 不同基因型材料的株高結(jié)果

選取91份春小麥育種材料，對其株高及其相關(guān)基因進(jìn)行分析，結(jié)果(表5)發(fā)現(xiàn)，含有Rht-B1b、Rht-D1b、Rht-B1b+Rht-D1b以及不含所檢測矮稈基因小麥材料的平均株高分別為 71.95、67.84、67.19和78.29 cm。多重比較結(jié)果(表5)表明，同時含有Rht-B1b和Rht-D1b矮稈基因小麥材料的平均株高最低，但與單獨含有Rht-D1b矮稈基因小麥材料的平均株高無顯著差異，而與單獨含有Rht-B1b矮稈基因和不含所檢測矮稈基因小麥材料的平均株高差異顯著，矮稈基因的分布及株高數(shù)據(jù)詳見表6。

表5 不同矮稈基因?qū)?1份春小麥育種材料株高的影響Table 5 Effect of different dwarfing genes on plant height of 91 Spring wheat breeding materials

表6 91份春小麥育種材料 Rht-B1b和 Rht-D1b的檢測結(jié)果及株高Table 6 Plant height and detection result of Rht-B1b and Rht-D1b in 91 Spring wheat breeding materials

(續(xù)表6 Continued table 6)

(續(xù)表6 Continued table 6)

3 討 論

本試驗利用Ellis等[13]發(fā)表的4對特異性分子標(biāo)記，其準(zhǔn)確性已經(jīng)過楊松杰等[15]、慕美財?shù)萚17]和唐 娜等[18]的驗證，該標(biāo)記多態(tài)性強且目的基因條帶清晰，可應(yīng)用于小麥分子標(biāo)記輔助育種試驗。小麥矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b為隱性基因，不宜于早代篩選, 但若利用分子標(biāo)記輔助選擇可提前獲得含有矮稈基因的小麥個體，加快小麥矮化育種進(jìn)程。本研究檢測的321份材料中，Rht-B1b矮稈基因的分布頻率高于Rht-D1b矮稈基因，這與梁 丹等[19]對263份CIMMYT材料的矮稈基因分子檢測結(jié)果一致。

本試驗對91份春小麥育種材料的株高進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)含有Rht-B1b、Rht-D1b、Rht-B1b+Rht-D1b以及不含所檢測矮稈基因小麥材料的平均株高分別為71.95、67.84、67.19和 78.29 cm，其中，單獨含有Rht-B1b、Rht-D1b矮稈基因小麥材料的平均株高與Miralles等[9]和Brner等[7]的研究結(jié)果基本一致；但在本研究中，雖然同時含有Rht-B1b和Rht-D1b矮稈基因小麥材料的平均株高最低，但可能由于本研究試驗材料品種數(shù)量的局限性，Rht-B1b和Rht-D1b矮稈基因同時存在時，降稈效應(yīng)沒有達(dá)到60%，與前人[9-10]研究結(jié)果不一致，所以，后期還需要加大樣本量來驗證這一結(jié)果。

多重比較分析發(fā)現(xiàn)，同時含有Rht-B1b和Rht-D1b矮稈基因小麥材料的平均株高最低，這些小麥材料共有26份，分別為07-7165、青春556、05cm178、05cm220、07-5866、08冬中788、08冬中3008、交原356、05-1173、格蘭尼、08冬中1146、05-1411、07-6228、08冬中5378、蘭雜7002、08冬中1807、輪選、臨優(yōu)一號、08-1312 、08冬中6741、07-6239、張掖1號、08-1826、08-3348、08-1699、08冬中2455。以上材料可在降低株高的抗倒伏育種中作為親本使用。