2，4-表油菜素內(nèi)酯對(duì)多菌靈處理下葡萄抗氧化代謝系統(tǒng)的影響

孫嘉華，李雨萌,凌 翰,惠竹梅

(西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

我國(guó)大多數(shù)地區(qū)屬于大陸性季風(fēng)氣候，雨熱同季。在黃河故道、環(huán)渤海灣、黃土高原等主要葡萄種植區(qū)域，夏秋多雨容易導(dǎo)致葡萄霜霉病、白腐病、炭疽病等真菌病害頻繁發(fā)生，因此，在葡萄栽培管理中常使用殺菌劑、殺蟲(chóng)劑等化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治真菌病害[1]。多菌靈是葡萄田間管理中廣泛使用的一種高效低毒殺菌劑，它屬于苯并咪唑類(lèi)農(nóng)藥，對(duì)許多子囊菌和半知菌有效，可干擾細(xì)菌有絲分裂中紡錘體的形成，影響細(xì)胞分裂，從而起到殺菌作用，常用于葡萄白腐病、黑痘病、炭疽病的防治[2]。但在葡萄栽培管理中經(jīng)常因?yàn)檗r(nóng)藥使用不當(dāng)，使大量有機(jī)物殘留在葡萄植株上，導(dǎo)致葡萄葉片萎黃、光合能力降低、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏以及生物量減少[3]，殘留的農(nóng)藥還會(huì)進(jìn)入葡萄果實(shí)或通過(guò)發(fā)酵進(jìn)入葡萄酒中影響葡萄酒的質(zhì)量安全，對(duì)人類(lèi)健康造成威脅[1]。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成了自身的解毒機(jī)制，它們將農(nóng)藥代謝為毒性較低的物質(zhì)隔離儲(chǔ)存起來(lái)從而達(dá)到解毒的目的，但由于植物自身解毒機(jī)制效率較低，所以需要通過(guò)物理、化學(xué)和生物手段加速農(nóng)藥殘留的降解[3]。油菜素內(nèi)酯可參與植物體內(nèi)多種生長(zhǎng)代謝和抗逆過(guò)程，在降解農(nóng)藥殘留方面有著較好的應(yīng)用前景。

油菜素內(nèi)酯 (Brassinosteroid, 簡(jiǎn)稱BR)是廣泛存在于植物中的甾醇類(lèi)激素，它在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用，可以緩解多種生物脅迫和非生物脅迫。已有研究表明：0.1 mg·L-1的外源2，4-表油菜素內(nèi)酯(EBR)預(yù)處理能通過(guò)改善葡萄葉片光合特性，減少其活性氧物質(zhì)和丙二醛(MDA)的積累以及提高解毒酶活性以促進(jìn)百菌清降解，從而緩解農(nóng)藥對(duì)葡萄植株的傷害[3]；當(dāng)葡萄遭受低溫脅迫時(shí)，外源BRs可通過(guò)提高植物體內(nèi)的保護(hù)酶活性、清除活性氧自由基而間接抑制過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量，從而減輕低溫誘導(dǎo)的氧化性損傷[4]；EBR預(yù)處理能夠通過(guò)提高黃瓜幼苗葉片的同化能力和抗氧化酶活性緩解多種農(nóng)藥的藥害[5]；在番茄、黃瓜等作物上噴灑多菌靈、毒死蜱和除蟲(chóng)菊酯等農(nóng)藥前，先噴灑少量油菜素內(nèi)酯作預(yù)處理，可以降低農(nóng)藥殘留30%～70%[6]；對(duì)植物用毒死蜱處理前先用EBR預(yù)處理可提高植物體內(nèi)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、過(guò)氧化物酶(POD)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性，從而能夠降低農(nóng)藥殘留[7]。有關(guān)外源EBR對(duì)農(nóng)藥多菌靈(CBD)脅迫下葡萄植株抗氧化系統(tǒng)的影響尚少見(jiàn)研究報(bào)道。本試驗(yàn)以歐亞種釀酒葡萄(VitisviniferaL.)赤霞珠(Cabernet Sauvignon)為試材，研究EBR預(yù)處理對(duì)CBD脅迫下葡萄植株抗氧化系統(tǒng)的影響，以期明確外源EBR對(duì)CBD脅迫下葡萄植株的生理調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院日光溫室及中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，供試品種為歐亞種釀酒葡萄(VitisviniferaL.)赤霞珠(Cabernet Sauvignon)2 a生葡萄盆栽苗。2017年6月進(jìn)行塑料盆扦插育苗，盆高18 cm、盆口外徑26 cm、盆口內(nèi)徑24 cm、盆底直徑14 cm，盆中營(yíng)養(yǎng)土重量約5 kg，營(yíng)養(yǎng)土配方為原土(V)∶珍珠巖(V)∶腐殖質(zhì)(V)=2∶1∶1。2017年12月移至西北農(nóng)林科技大學(xué)楊凌區(qū)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)溫室中進(jìn)行正常管理。2018年4月中旬當(dāng)赤霞珠葡萄盆栽苗生長(zhǎng)至10～12片完全展開(kāi)葉時(shí)，選擇生長(zhǎng)狀況基本一致的盆栽苗進(jìn)行試驗(yàn)處理。

EBR購(gòu)自加拿大TRC公司；多菌靈可濕性粉劑(50%)購(gòu)自四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)CK、稀釋800倍CBD、0.3 mg·L-1EBR+稀釋800倍CBD 3種處理，每種處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5株葡萄苗。試劑使用濃度和采樣時(shí)間根據(jù)課題組關(guān)于EBR處理對(duì)葡萄盆栽苗的影響研究而定[3, 8]。噴施前EBR和CBD都先用98%的乙醇溶解，再稀釋到試驗(yàn)設(shè)置濃度，并使乙醇最終含量為0.1%(v/v)，同時(shí)加入終濃度0.1%(v/v)的吐溫-80，配好的EBR溶液和CBD溶液避光冷藏保存。清水中也加入同樣體積的98%乙醇和吐溫-80。試驗(yàn)選在晴朗、無(wú)風(fēng)且日照較弱的下午進(jìn)行，首先分別對(duì)CK、CBD與EBR+CBD處理組葡萄盆栽苗葉片噴施清水、清水、0.3 mg·L-1EBR，間隔24 h后再分別對(duì)上述各處理組葡萄盆栽苗葉片噴施清水、稀釋800倍CBD、稀釋800倍CBD。各處理用容量0.8 L的噴壺噴施葡萄盆栽苗所有葉片的正、反兩面，以葉面滴水為止。記多菌靈處理當(dāng)天為第0天，分別在多菌靈處理后的第1、3、5、7、9天采樣，每株葡萄苗選取其2～6節(jié)位長(zhǎng)勢(shì)相同的葉片隨機(jī)采樣，采集的葉片去除主葉脈后剪成細(xì)絲狀，每個(gè)樣品混合均勻后放入-40℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于各?xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用鄧肯氏法進(jìn)行多重比較，對(duì)于同一個(gè)測(cè)定指標(biāo)，分析同一時(shí)間點(diǎn)上3個(gè)處理之間的差異顯著性，用不同小寫(xiě)字母表示(P<0.05)，圖中的短線代表標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR對(duì)CBD處理下葡萄葉片含量的影響

2.2 EBR對(duì)CBD處理下葡萄葉片GSH和AsA含量的影響

從圖2可以看出，CBD處理的葡萄葉片GSH含量與對(duì)照相比無(wú)顯著變化；與CBD處理相比，除第1天和第9天外，EBR+CBD處理使葡萄葉片GSH含量顯著升高，平均比CBD處理升高5.46%。

在整個(gè)處理過(guò)程中，與對(duì)照相比，CBD處理使葡萄葉片AsA含量略微升高，平均比對(duì)照升高2.52%；與CBD處理相比，除第1天外，EBR+CBD處理使葡萄葉片AsA含量顯著升高，平均比CBD處理升高24.92%。說(shuō)明0.3 mg·L-1EBR預(yù)處理可顯著提高農(nóng)藥脅迫下葡萄葉片的抗氧化物質(zhì)含量，提高葡萄盆栽苗對(duì)農(nóng)藥的抗性。

2.3 EBR對(duì)CBD處理下葡萄葉片抗氧化酶活性的影響

由圖3可以看出，在整個(gè)處理過(guò)程中，與對(duì)照相比，CBD處理使葡萄葉片CAT、POD活性顯著增強(qiáng)；除第1天和第9天外，CBD處理使葡萄葉片GR活性顯著高于對(duì)照；與CBD處理相比，EBR+CBD處理使葡萄葉片CAT、GR活性分別在處理5天后和處理3～7 d顯著增強(qiáng)，平均比CBD處理分別升高17.15%、5.33%；除第7天外，EBR+CBD處理與CBD處理的葡萄葉片POD活性均無(wú)顯著差異。該結(jié)果表明0.3 mg·L-1EBR預(yù)處理主要通過(guò)增加抗氧化酶CAT、GR的活性來(lái)有效增強(qiáng)葡萄盆栽苗對(duì)農(nóng)藥多菌靈的抗性，但對(duì)POD的活性影響不顯著。

3 討 論

3.1 外源EBR處理降低CBD脅迫下葡萄活性氧類(lèi)物質(zhì)含量

3.2 外源EBR處理提高CBD脅迫下葡萄葉片抗氧化物質(zhì)含量

植物體內(nèi)ROS的清除主要依靠?jī)商卓寡趸到y(tǒng)：一類(lèi)是抗氧化物質(zhì), 另一類(lèi)是抗氧化酶系統(tǒng)[17]。GSH和AsA是植物體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，它們能夠與ROS反應(yīng)直接清除ROS或作為抗氧化酶的底物間接清除ROS[8]，從而降低植物細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的含量，避免過(guò)多的ROS物質(zhì)對(duì)植物造成傷害。已有研究表明外源EBR處理可以提高農(nóng)藥百菌清[3]、低溫[4]等非生物脅迫下葡萄抗氧化物質(zhì)GSH和AsA的含量，提高葡萄植株的抗性。本試驗(yàn)中用稀釋800倍的CBD處理使葡萄盆栽苗葉片中GSH和AsA的含量升高，可能因?yàn)樵摑舛鹊霓r(nóng)藥刺激了葡萄體內(nèi)的防御機(jī)制，從而產(chǎn)生更多的保護(hù)物質(zhì)。EBR預(yù)處理后進(jìn)一步提高了葡萄葉片中GSH和AsA的含量，這與吳雪霞[15]、彭小琴[3]等的研究一致，說(shuō)明外源EBR可以通過(guò)提高葡萄盆栽苗葉片內(nèi)抗氧化物質(zhì)GSH和AsA的含量而增強(qiáng)其對(duì)農(nóng)藥脅迫的抗性。

3.3 外源EBR處理提高CBD脅迫下葡萄葉片抗氧化酶活性

抗氧化酶系統(tǒng)是植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)重要的防御系統(tǒng)，CAT、POD和GR是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶，POD與CAT共同作用消除植物細(xì)胞內(nèi)過(guò)多H2O2，GR活性的增強(qiáng)促進(jìn)抗氧化物質(zhì)GSH含量的升高[18]，它們之間的協(xié)同作用可以防止活性氧自由基對(duì)細(xì)胞膜造成傷害, 抑制膜脂過(guò)氧化, 減輕逆境脅迫對(duì)植物的傷害[19-20]?？芙瓭萚21]研究表明，外源EBR可顯著增加NaCl鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗根系的抗氧化酶活性；在低溫脅迫下，外源EBR處理可顯著增強(qiáng)葡萄幼苗的抗氧化酶活性[4]，提高植物的抗性。本試驗(yàn)中CBD處理使葡萄葉片抗氧化酶CAT、POD、GR活性顯著增強(qiáng)，可能經(jīng)稀釋800倍的CBD處理刺激了葡萄盆栽苗的應(yīng)激保護(hù)功能，通過(guò)提高抗氧化酶的活性保護(hù)細(xì)胞免受氧化損害；與單獨(dú)CBD處理相比，EBR+CBD處理進(jìn)一步增強(qiáng)了抗氧化酶CAT、GR的活性，但對(duì)POD活性作用效果不明顯，說(shuō)明EBR預(yù)處理可能主要通過(guò)增加葡萄抗氧化酶CAT、GR的活性來(lái)有效增強(qiáng)葡萄盆栽苗對(duì)農(nóng)藥多菌靈的抗性。

4 結(jié) 論