PEG 6000模擬干旱脅迫下甘藍型油菜芽期及苗期抗旱指標(biāo)篩選

劉 翔，左凱峰，許 偉，郭 娜，秦夢凡，徐 宇，馬 寧，李青青，張 淼，李浩東，王茸茸，黃 鎮(zhèn)，徐愛遐

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.勉縣原種場，陜西 勉縣 724200)

水資源短缺是一個全球性問題，干旱是制約農(nóng)業(yè)發(fā)展最嚴(yán)重的非生物因素之一[1]，每年我國農(nóng)業(yè)均因干旱造成重大損失[2]。油菜是我國第一大油料作物，在國民經(jīng)濟中占有重要的地位[3]。我國目前種植油菜中大部分為甘藍型油菜，甘藍型油菜整個生長期需水量較大，對干旱的適應(yīng)性較差，干旱不僅制約著產(chǎn)量的提升，也制約著種植面積的擴大[4]。因此，在油菜生產(chǎn)中耐旱性研究是一項非常重要并且十分緊迫的任務(wù)。

干旱脅迫后植物會產(chǎn)生一系列的形態(tài)、生理變化，如根長、含水量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性等?？赏ㄟ^植物受到干旱脅迫后的形態(tài)、生理指標(biāo)變化來鑒定其對干旱的敏感程度[5]。許媛君[6]利用PEG 6000模擬干旱脅迫研究白菜型油菜芽期抗旱性，認(rèn)為發(fā)芽率可作為白菜型油菜抗旱種質(zhì)篩選的重要依據(jù)；胡承偉等[7]研究認(rèn)為相對活力指數(shù)可作為油菜芽期抗旱性篩選的重要依據(jù)；王道杰等[8]通過對油菜苗期抗旱性研究，表明可溶性蛋白、SOD、CAT可作為抗旱性鑒定指標(biāo)。

作物抗旱機制十分復(fù)雜，受到遺傳因素、發(fā)育時期和環(huán)境的綜合影響。因此，不同發(fā)育階段的抗旱機制可能不同，導(dǎo)致作物不同發(fā)育階段抗旱性強弱可能存在差別。不同年份和地區(qū)干旱發(fā)生的時期不同，明確作物種質(zhì)不同生長期抗旱性強弱，能更好地發(fā)揮種質(zhì)優(yōu)勢，以適應(yīng)不同環(huán)境，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。作物抗旱涉及到不同時期大量形態(tài)、生理生化指標(biāo)的變化，給作物抗旱性鑒定帶來了困難。篩選出能夠準(zhǔn)確評價抗旱性的指標(biāo)對于研究作物抗旱性具有重要的意義。抗旱性綜合度量值(D值)綜合了各指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系及貢獻，能夠消除單一指標(biāo)的局限性，得到較為準(zhǔn)確的抗性評估，被廣泛應(yīng)用于作物的抗旱性評價[9-10]。

目前對于甘藍型油菜的抗旱性研究大多只是芽期或苗期等單一時期，本研究對8份種質(zhì)材料在芽期及苗期(五葉期)利用PEG 6000模擬干旱脅迫，分析其形態(tài)、生理指標(biāo)變化，綜合評價甘藍型油菜芽期和苗期抗旱性，篩選芽期和苗期抗旱性評價指標(biāo)，為油菜抗旱育種研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究供試材料為西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院油菜育種課題組前期培育鑒定的8份抗旱性不同的甘藍型油菜骨干種質(zhì)，編號分別為640，876，899，1057，1105，1876，2351和2417。

表1 供試材料Table 1 Test materials

1.2 試驗方法

試驗于2020年5—7月在西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜育種實驗室的油菜培養(yǎng)間進行。

1.2.1 芽期鑒定 8個種質(zhì)材料各取大小均勻、飽滿、無病蟲害的50粒種子滅菌后置于90 mm×15 mm的培養(yǎng)皿中，其中已放置滅菌后的一層濾紙和一層吸水紙作為芽床，分別加6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%的PEG 6000溶液進行處理，對照加等量蒸餾水，試驗重復(fù)3次，置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中于16 h/8 h的光/暗條件培養(yǎng)7 d，記錄發(fā)芽數(shù)及成苗數(shù)(將子葉展開成為正常幼苗記為成苗)，計算發(fā)芽率(GR)和成苗率(SR)。

1.2.2 苗期鑒定 上述8個材料種子正常發(fā)芽6 d后，各取長勢一致的60株幼苗移栽至裝有5 L 50% Hoagland營養(yǎng)液的水培盆中，隔4 d換一次營養(yǎng)液，待植株長至3葉期時更換為全營養(yǎng)液，置于25℃的恒溫光照培養(yǎng)室中于16h/8 h的光/暗條件培養(yǎng)。幼苗培養(yǎng)至五葉期時，參考王衛(wèi)芳[11]的方法，使用PEG 6000配置的滲透勢為-0.14 MPa的營養(yǎng)液(2% PEG 6000)適應(yīng)3 d后，改用PEG 6000配置的滲透勢為-0.36 MPa的Hoagland營養(yǎng)液(4% PEG 6000)繼續(xù)培養(yǎng)4 d，對照一直用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，每個材料處理10株，對照10株，重復(fù)3次。處理后觀察表型、取樣，參考植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[12-13]測定相關(guān)指標(biāo)。利用稱重法測量根冠比(RSR)和葉片相對含水量(RWC)；用葉綠素儀(型號：SPAD-502Plus；品牌：柯尼卡美能達； 產(chǎn)地：日本)測定SPAD值。丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法，可溶性糖(SSu)含量測定采用蒽酮法，可溶性蛋白(SPr)含量采用考馬斯亮藍G-250法測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)法，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法。根冠比取整株測定，其余指標(biāo)均取第三片葉測定，取2株葉片混樣為一個重復(fù)，共3個重復(fù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 利用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行匯總整理，使用SPSS 25.0和GraphPad 8.4進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖。

1.2.4 抗旱性綜合評價方法 計算抗旱系數(shù)、隸屬函數(shù)值、抗旱性量度值D。主要公式如下[9]：

(1)抗旱系數(shù)Xj

Xj=各指標(biāo)干旱處理測量值/對照測量值

(2)隸屬函數(shù)值μ(Xj)

μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，Xj代表各指標(biāo)的抗旱系數(shù)，Xmin代表該指標(biāo)抗旱系數(shù)最小值，Xmax代表該指標(biāo)抗旱系數(shù)最大值。

(3)權(quán)重Wj

式中，Pj代表單個因子貢獻率，Wj為該因子在所有公因子中的重要程度。

(4)抗旱性綜合度量值D

式中，D值為不同甘藍型油菜種質(zhì)抗旱性綜合度量值，n為指標(biāo)個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽期模擬干旱脅迫最適PEG濃度及鑒定指標(biāo)

由圖1可知，在不同濃度PEG 6000溶液處理下，8份材料對照組(CK)、5%、10%、15%處理組均有正常成苗，20%處理組均有發(fā)芽但無正常成苗，25%處理組既無發(fā)芽也無成苗。與CK相比，5%、10%、15% PEG處理下，1057發(fā)芽率有所升高，其余材料無明顯變化，且8份材料各處理間發(fā)芽率無明顯差異；20% PEG處理下，8份材料發(fā)芽率顯著降低，且各材料間差異顯著；25%處理組，8份材料均無發(fā)芽。8份材料的成苗率在5%處理下與CK相比無明顯差異；在10% PEG處理下，1105和2351顯著下降，其余材料無明顯變化；15%處理組，成苗率顯著降低，且8份材料間差異顯著；20%和25% PEG處理下，8份材料無正常成苗。表明PEG處理下，發(fā)芽的臨界濃度為20%，成苗的臨界濃度為15%，成苗率相比于發(fā)芽率對PEG濃度的增加更敏感。不同濃度PEG處理下，8份材料發(fā)芽和成苗率的變化并不一致，說明干旱條件下，發(fā)芽的種子并不一定能成長為正常的幼苗，用發(fā)芽率來評價種質(zhì)的抗旱性與實際生產(chǎn)中的抗旱性可能會有較大偏差，而PEG模擬干旱脅迫下的成苗率代表了種質(zhì)在干旱條件下的成苗能力，與實際干旱條件下種質(zhì)的生長表現(xiàn)更接近，對實際生產(chǎn)中抗旱品種的選育更有指導(dǎo)意義。15% PEG處理下，8份供試材料成苗率差異顯著，因此，15%是鑒定甘藍型油菜芽期抗旱性的最適PEG濃度，成苗率可作為甘藍型油菜芽期抗旱種質(zhì)鑒定的方便直觀、相對準(zhǔn)確的指標(biāo)。根據(jù)15% PEG處理下8份材料的成苗率，將8份材料芽期抗旱性劃分為3個等級：1057為芽期強抗旱型，640、1876、899、2417和876為芽期中等抗旱類型，1105和2351為芽期敏旱型材料。

2.2 甘藍型油菜苗期抗旱性鑒定及抗旱指標(biāo)篩選

2.2.1 苗期相關(guān)指標(biāo)對干旱脅迫的響應(yīng) 利用公式(1)計算出各個指標(biāo)的抗旱系數(shù)(表2)，抗旱系數(shù)大小反映了各指標(biāo)處理前后的差異，抗旱系數(shù)大于1，說明干旱處理后該指標(biāo)相對于對照上升，數(shù)值越大上升越明顯；反之，抗旱系數(shù)小于1，說明指標(biāo)下降，數(shù)值越小下降越明顯。據(jù)表2可知，各指標(biāo)對于干旱脅迫的響應(yīng)差異較大。與對照相比，SPAD值變化幅度較小，材料899抗旱系數(shù)最大，為1.36，1105最小，為0.8，供試材料平均抗旱系數(shù)為1.08。干旱脅迫下，除1876外，其余材料根冠比的抗旱系數(shù)均大于1，平均抗旱系數(shù)為1.48，說明干旱脅迫會促進根系生長獲得更多水分從而提高根冠比。各供試材料葉片相對含水量相對于對照均明顯下降，其中，640在干旱脅迫下的葉片保水能力最強，抗旱系數(shù)為0.85，2417保水能力最差，抗旱系數(shù)為0.67，說明不同材料在干旱脅迫下的水分調(diào)節(jié)能力不同。所有材料的可溶性糖、可溶性蛋白及丙二醛含量在干旱脅迫下均呈現(xiàn)不同程度升高，與對照相比，可溶性蛋白含量提升最大的是640，最小的是2417；可溶性糖含量最大的材料為1057，最小的是899；丙二醛含量最大的材料為899，最小的是640。與對照相比，大部分材料的抗氧化酶活性在干旱脅迫下明顯上升，如640、1876等，而部分材料活性降低，如1057。上述結(jié)果表明，各指標(biāo)對干旱脅迫的敏感程度不同，加之測量過程中可能出現(xiàn)的誤差，很難通過單個指標(biāo)客觀、準(zhǔn)確地反映種質(zhì)的抗旱性，因此，必須通過多指標(biāo)進行綜合評價。

表2 甘藍型油菜苗期各生理指標(biāo)的抗旱系數(shù)Table 2 Drought resistance coefficients of physiological indexes at seedling stage of Brassica napus L.

2.2.2 苗期抗旱相關(guān)指標(biāo)的主成分分析 為進一步明確甘藍型油菜苗期各指標(biāo)與抗旱性的關(guān)系，從而準(zhǔn)確鑒定甘藍型油菜苗期抗旱性，對苗期抗旱相關(guān)指標(biāo)進行了主成分分析。由表3可知，3個主成分貢獻率分別為56.2%、21.7%、14.8%，累計貢獻率達到92.7%，覆蓋了絕大部分的原始數(shù)據(jù)信息。決定主成分1大小的主要是相對含水量、可溶性蛋白和可溶性糖。說明主成分1代表的是水分調(diào)節(jié)因子，在植株受到干旱脅迫時有效調(diào)控，防止水分過量喪失；主成分2中載荷最高的是SOD和POD，代表了活性氧清除系統(tǒng)，降低植株在受到脅迫時因活性氧積累造成的傷害；主成分3中SPAD載荷量最高，POD次之。

表3 甘藍型油菜苗期各生理性狀的主成分分析Table 3 Principal component analysis of physiological characters at seedling stage of Brassica napus L.

2.2.3 苗期抗旱性綜合評價 用公式(2)計算各指標(biāo)隸屬函數(shù)值，通過主成分分析及公式(3)計算出各抗旱指標(biāo)權(quán)重，再用公式(4)計算抗旱綜合度量值D，對8份材料進行排序，D值越大抗旱性越強，D值越小抗旱性越弱。由表4可知，8份材料中，D值范圍在-0.161～0.993之間。按D值對8份材料進行抗旱性排序，8份材料苗期抗旱性強弱排序為640>1057>1876>2351>1105>876>899>2417。這與芽期抗旱性鑒定結(jié)果不完全一致，其中有些材料芽期和苗期的抗旱性基本一致，如1057、640和1876，而部分材料芽期和苗期抗旱性排名差異較大，如1105芽期抗旱性在8份材料中最差，苗期處于中等水平；2417芽期抗旱性表現(xiàn)為中等，而苗期表現(xiàn)最差。綜上，甘藍型油菜抗旱機制的復(fù)雜導(dǎo)致了其在不同生長時期的抗旱性發(fā)生了變化。因此，在不同時期抗旱性鑒定中方法和指標(biāo)的選擇十分重要。

表4 甘藍型油菜苗期抗旱性綜合評價排序Table 4 Ranking of comprehensive evaluation of drought resistance of Brassica napus L.

2.2.4 抗旱指標(biāo)與抗旱性度量值的相關(guān)性分析 為進一步確定甘藍型油菜苗期抗旱性鑒定指標(biāo)，將苗期抗旱相關(guān)指標(biāo)的抗旱系數(shù)與苗期抗旱綜合度量值D值進行了相關(guān)性分析(表5)。結(jié)果表明，葉片相對含水量(0.907**)、可溶性蛋白含量(0.921**)與D值呈極顯著正相關(guān)，丙二醛含量(-0.837**)與D值呈極顯著負(fù)相關(guān)，其余指標(biāo)與D值也有相關(guān)性，但不顯著。說明相對含水量、可溶性蛋白和丙二醛含量可作為苗期抗旱性鑒定的有效指標(biāo)。

表5 苗期抗旱指標(biāo)與D值的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of drought resistance index and D value at seedling stage

3 討論與結(jié)論

目前作物抗旱性鑒定主要采用土壤干旱法和高滲溶液模擬干旱法，后者由于操作簡單、省時省力，并能夠相對準(zhǔn)確地控制脅迫程度而被廣泛應(yīng)用。其中PEG 6000由于其分子量大，不會進入植物細(xì)胞，除滲透脅迫外對植物造成的其他影響較小而被認(rèn)為是干旱模擬的理想滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[14]，從而廣泛應(yīng)用于油菜[15]、玉米[16]、小麥[17]、高粱[18]、大麥[19]等作物的抗旱性研究。選擇適當(dāng)濃度的PEG對于研究不同作物、不同發(fā)育時期的抗旱性是必要的。本研究采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG溶液對甘藍型油菜芽期抗旱性進行分析，發(fā)現(xiàn)15%處理組供試材料抗旱性有明顯差異，將15%作為甘藍型油菜芽期抗旱性鑒定的最適PEG濃度。

發(fā)芽期是作物生長的關(guān)鍵期，播種后遭遇干旱會導(dǎo)致成苗減少，造成減產(chǎn)。很多研究[20-22]認(rèn)為，發(fā)芽率可作為作物芽期抗旱性鑒定的指標(biāo)，本研究通過比較PEG 6000模擬干旱脅迫下8份甘藍型油菜發(fā)芽率及成苗率的變化，發(fā)現(xiàn)成苗率比發(fā)芽率對于干旱脅迫更敏感，與實際生產(chǎn)的聯(lián)系更大，因此，成苗率比發(fā)芽率更適合作為芽期抗旱性的鑒定指標(biāo)。植物受到干旱脅迫時，不僅會失水影響正常生長，還會加快活性氧的積累，嚴(yán)重時導(dǎo)致植株死亡[23]。滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)和活性氧清除系統(tǒng)是植物應(yīng)對干旱脅迫的重要途徑。缺水時植物體內(nèi)會逐漸積累一些小分子的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要有脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿、游離氨基酸等，植物通過這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)保持細(xì)胞水分，維持細(xì)胞膨壓[24]；同時，抗氧化酶(SOD、POD、CAT)能夠有效清除植物體內(nèi)積累的活性氧，減輕植物受到的損傷[25]，從而維持植物的生長。桂月晶等[26]研究表明，脯氨酸、可溶性蛋白含量和SOD、POD活性與抗旱性呈正相關(guān)；謝小玉等[27]對油菜苗期抗旱性進行研究，認(rèn)為葉片相對含水量、丙二醛和葉面積可作為油菜苗期抗旱性鑒定的依據(jù)。本研究中葉片相對含水量、可溶性蛋白含量與抗旱性呈顯著正相關(guān)，丙二醛含量與抗旱性呈顯著負(fù)相關(guān)，這與前人研究基本一致。

本研究對8個甘藍型油菜種質(zhì)芽期及苗期的抗旱性進行了鑒定，結(jié)果表明，甘藍型油菜芽期和苗期抗旱性不完全一致，甘藍型油菜種質(zhì)的抗旱性不能由某個發(fā)育階段的抗旱性來決定。成苗率可作為芽期抗旱性鑒定指標(biāo)，葉片相對含水量、可溶性蛋白含量及丙二醛含量與苗期抗旱性顯著相關(guān)，這些指標(biāo)在甘藍型油菜抗旱性評價中可優(yōu)先考慮。