解鉀菌與鹽脅迫對枸杞幼苗根系特征和生理代謝的影響

朱娟娟，馬海軍，覃洪云，徐小云，張 琇,3

(1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心，寧夏 銀川 750021；3. 寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，寧夏 銀川 750021)

土壤鹽漬化是威脅全球農(nóng)作物生長發(fā)育的主要非生物因素之一[1-2]，過量的鈉離子引起植物細(xì)胞脫水損傷，減少膨脹壓力，破壞關(guān)鍵生化過程，降低植物葉片光合能力，嚴(yán)重抑制作物的生長和產(chǎn)量，并會造成品質(zhì)的下降[3]。據(jù)統(tǒng)計，目前全球20%的耕地受鹽堿化的影響，未來25 a將有超過25%的耕地遭受鹽堿化和土壤退化[4-5]。因此，緩解鹽分脅迫和尋求土壤鹽漬化解決方案將對農(nóng)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展至關(guān)重要。

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科(Solanaceae)藥食同源的落葉灌木，具有耐土壤貧瘠、耐鹽堿、抗旱、抗寒等特點，其果實藥用價值高，可作為保健食品和藥品提高人體免疫力，具有滋肝、補腎、明目等功效，是寧夏重要的經(jīng)濟果林樹種，也是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的主要來源。寧夏引黃灌區(qū)鹽漬化耕地占總耕地面積的33.5%，在堿性土壤和鹽漬化耕地上枸杞生產(chǎn)發(fā)展迅速，但其產(chǎn)量和品質(zhì)受鹽堿脅迫的影響是目前亟需解決的問題[6]。植物根際促生菌(PGPR)是植物根際土壤中一類可以促進植物生長的有益微生物，并且能夠防治病害、增加作物產(chǎn)量以及減輕植物承受鹽脅迫的壓力，提高植物的抗性，故接種PGPR已經(jīng)成為一種環(huán)境友好、經(jīng)濟有效的促進植物在鹽漬化土壤中生長的發(fā)展策略[7-8]。解鉀菌是植物根際促生菌的一種，能分解長石、云母等硅酸鹽類原生態(tài)礦物，使土壤中難溶性鉀、磷、硅等元素轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇軕B(tài)的一類細(xì)菌，有的亦有固氮、溶磷、產(chǎn)生植物生長激素(生長素、細(xì)胞分裂素、乙烯、吲哚乙酸和赤霉素)和有機酸的作用[9]，能夠通過各種直接和間接作用促進植物的生長。研究表明，解鉀菌能夠通過產(chǎn)生鐵載體、抗生素、硫化氫、抗真菌化合物、淀粉水解和纖維素降解等來促進作物生長、改善作物品質(zhì)以及增強作物的抗逆性[10-12]。在逆境條件下，根系形態(tài)特征及活力狀態(tài)是植物對土壤養(yǎng)分有效吸收和利用最直接的適應(yīng)性特征之一，并且根系也是植物合成氨基酸和激素等物質(zhì)的主要場所，其形態(tài)特征和活力狀態(tài)與植株地上部各器官的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的形成密切相關(guān)[13]。當(dāng)植物處于鹽脅迫環(huán)境中時，根系是植物第一個接觸、感知和響應(yīng)土壤鹽分的器官[14]，高鹽離子濃度對根系結(jié)構(gòu)和滲透作用、離子平衡及水分養(yǎng)分運輸?shù)榷喾N生物過程均有負(fù)面影響[15]。前人研究已表明：解鉀菌能夠增加幼苗胚根長和根系干重，對植物根系生長有較好的促生效應(yīng)[16]。然而，鹽脅迫下解鉀菌調(diào)控枸杞幼苗根系生長發(fā)育的研究報道甚少。因此，本研究以‘寧杞1號’為研究對象，通過苗期盆栽試驗，探究兩株解鉀菌對鹽脅迫下枸杞幼苗根系結(jié)構(gòu)特征和根系生理指標(biāo)及蔗糖代謝酶活性的影響，揭示解鉀菌和鹽脅迫對枸杞幼苗根系生長發(fā)育的調(diào)控機制，為合理利用微生物菌肥、提高寧夏枸杞產(chǎn)量和改善其品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以寧夏當(dāng)家品種‘寧杞1號’實生苗為試材，解鉀菌由寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室提供，是從寧夏固原市原州區(qū)閆堡村鹽堿地土壤中自行分離得到的KSBGY01和KSBGY02兩株菌，其解鉀效率分別為12.8%和21.1%，分泌吲哚乙酸的量分別為11.32 mg· L-1和17.53 mg· L-1。本試驗于2019年5―10月在寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室進行。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用雙因素裂區(qū)設(shè)計，主因素為鹽脅迫，副因素為解鉀菌，共8個處理，分別為：CK：不添加NaCl和菌劑；B1：不添加NaCl，添加KSBGY01解鉀菌發(fā)酵液5 mL；B2：不添加NaCl，添加KSBGY02解鉀菌發(fā)酵液5 mL；B3：不添加NaCl，添加KSBGY01菌∶KSBGY02菌=1∶1的發(fā)酵液5 mL；NaCl-CK：100 mmol·L-1NaCl，不添加菌劑；NaCl-B1：100 mmol·L-1NaCl，添加KSBGY01解鉀菌發(fā)酵液5 mL；NaCl-B2：100 mmol·L-1NaCl，添加KSBGY02解鉀菌發(fā)酵液5 mL；NaCl-B3：100 mmol·L-1NaCl，添加KSBGY01菌∶KSBGY02菌=1∶1的發(fā)酵液5 mL，每個處理重復(fù)5次。

將枸杞種子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的KMnO4溶液浸泡消毒30 min后[17]，用無菌水快速沖洗至無色，于室溫下用無菌水浸泡10 h，再用無菌水沖洗3次。將表面消毒后的種子均勻鋪在濕潤的無菌紗布上，表面再蓋上一層紗布，置于25℃培養(yǎng)箱中催芽。基質(zhì)按照蛭石∶珍珠巖∶細(xì)沙=1∶1∶2(體積比)混合后清洗晾干[18]，于250℃的烘箱中烘30 min，等恢復(fù)到室溫后裝于上口徑100 mm、底徑70 mm、高度88 mm的營養(yǎng)缽中，每盆裝基質(zhì)1.5 kg，用無菌鑷子將出芽的種子移入營養(yǎng)缽，每盆5粒種子，并在表面覆蓋一層蛭石，然后加入適量滅菌的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)60 d，選取長勢優(yōu)良、大小一致的苗木進行移栽。為了避免鉀元素對試驗的影響，用無菌水洗去幼苗根部的細(xì)沙，移入裝有2.5 kg滅菌細(xì)沙和3 g鉀長石粉的花盆(上口徑16 cm、下口徑13 cm、高度17.5 cm)中，隨后用滅菌的無鉀Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)10 d后進行鹽處理和添加不同解鉀菌發(fā)酵菌液(108CFU·mL-1)，無菌對照添加發(fā)酵培養(yǎng)基5 mL，每2 d用稱重法添加營養(yǎng)液，培養(yǎng)15 d后結(jié)束試驗并切下根系進行數(shù)據(jù)測定。

1.3 測定指標(biāo)與方法

根系結(jié)構(gòu)特征分析采用植物根系分析儀測定(LA-S型，杭州萬深檢測科技有限公司，中國)；根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定[19]：超氧陰離子產(chǎn)生速率采用羥胺氧化法測定[20]；H2O2含量采用高錳酸鉀滴定法測定；可溶性糖含量采用蒽酮法測定[21]；超氧化物歧化酶活性(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化學(xué)還原法測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用過氧化氫紫外分光光度法測定；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SS)及轉(zhuǎn)化酶(INV)活性均采用南京建成生物有限公司酶聯(lián)試劑盒測定。

1.4統(tǒng)計分析

本試驗采用SPSS 24.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，不同處理間差異比較采用最小顯著差別(Least Significant Difference，LSD)法進行多重比較，利用Microsoft Excel 2013軟件作圖。采用主成分分析法來綜合評價解鉀菌對鹽脅迫下枸杞幼苗根系生理生化特性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫和解鉀菌對枸杞幼苗根系形態(tài)特征的影響

由表1可知，鹽脅迫顯著降低枸杞幼苗根系總長度，約減小32.9%；但提高根系平均直徑，約增加17.4%；而對根系投影面積、表面積、體積和根尖數(shù)無顯著性影響。解鉀菌除對枸杞幼苗根尖數(shù)無顯著影響外，對根系形態(tài)特征其他指標(biāo)均有顯著影響。與不添加解鉀菌相比較，B1、B2、B3解鉀菌使枸杞苗根系投影面積分別增加2.0%、24.0%、6.8%；根系表面積分別增加2.0%、24.0%和5.9%；根系平均直徑分別減少20.4%、2.99%、34.7%；B1和B2解鉀菌使枸杞幼苗根系總長度增加53.8%和1.17%，而B3解鉀菌使其降低0.45%；B2解鉀菌使枸杞幼苗根系體積增加43.7%，而B1和B3解鉀菌使其降低5.3%和34.2%。同時，鹽脅迫與解鉀菌交互作用對根系總長度、投影面積、表面積、體積和根尖數(shù)均有顯著影響。不同處理間相比較，B1處理中枸杞幼苗根系總長度顯著高于其他處理，B2處理中枸杞根系的投影面積、表面積和體積均顯著高于其他處理，NaCl-CK處理中枸杞幼苗根系平均直徑最大，并顯著高于B1、B3和NaCl-B3處理，NaCl-B1處理中枸杞幼苗根尖數(shù)最大。

表1 鹽脅迫與解鉀菌對枸杞幼苗根系結(jié)構(gòu)特征的影響Table 1 Effect of salt stress and potassium-solubilizing bacteria on root structure of Lycium barbarum seedlings

2.2 鹽脅迫和解鉀菌對枸杞幼苗根系活力的影響

由圖1可知，鹽脅迫對枸杞幼苗根系活力無顯著影響(P>0.05)，而解鉀菌及其交互作用對根系活力有極顯著影響(P<0.01)。非鹽脅迫下，不同解鉀菌處理中枸杞幼苗根系活力無顯著差異；而鹽脅迫下，添加B1解鉀菌(NaCl-B1)能夠顯著提高根系活力，雖然NaCl-B2和NaCl-B3處理與NaCl-CK處理間無顯著差異，但其根系活力均有所下降。

不同處理間相比較，NaCl-B1處理中根系活力最強，并顯著高于其他處理，分別比CJ、NaCl-CK、B1、B2、NaCl-B2、B3、NaCl-B3處理中根系活力高31.9%、66.2%、33.0%、34.8%、126.4%、43.8%、88.4%；而CK、NaCl-CK、B1、B2和B3處理間無顯著性差異；NaCl-B2處理中根系活力顯著低于其他處理(除NaCl-B3處理)。

2.3 鹽脅迫和解鉀菌對枸杞幼苗根系中活性氧含量的影響

2.4 鹽脅迫和解鉀菌對枸杞幼苗根系抗氧化酶活性的影響

鹽脅迫和解鉀菌及其交互作用對根系SOD、CAT和POD酶活性無顯著影響(P>0.05)，而對GSH-Px酶活性有顯著影響(P<0.05)。由圖3可知，非鹽脅迫下，B3解鉀菌處理顯著降低根系GSH-Px活性，而B1和B2與對照(CK)間均無顯著差異；鹽脅迫下，不同解鉀菌處理與對照(NaCl-CK)間均無顯著差異。不同處理相比較，NaCl-B1處理中枸杞幼苗根系GSH-Px活性最高，并且顯著高于CK、B1、B2和B3處理，分別比CK、NaCl-CK、B1、B2、NaCl-B2、B3、NaCl-B3處理高84.6%、22.6%、62.6%、84.0%、22.2%、167.1%、31.4%。

2.5 鹽脅迫和解鉀菌對枸杞幼苗根系可溶性糖含量及其相關(guān)酶活性的影響

由圖4可知，鹽脅迫對枸杞幼苗根系可溶性糖含量無顯著性影響(P>0.05)，而解鉀菌對其有顯著性影響(P<0.05)，其中B1、B2和B3解鉀菌均能明顯提高枸杞幼苗根系可溶性糖含量。不同處理間比較，NaCl-B2處理中幼苗根系可溶性糖含量最高，分別比CK、NaCl-CK、B1、NaCl-B1、B2、B3、NaCl-B3處理高38.5%、32.0%、0.7%、0.7%、1.4%、14.1%、4.8%。

非鹽脅迫下，解鉀菌顯著降低根系SS活性，而對SPS和INV酶活性無顯著影響；鹽脅迫下，解鉀菌能夠顯著提高根系SPS酶活性，但對SS酶活性的影響因解鉀菌不同有所不同，其中B1和B2單菌能夠提高SS酶活性，而混合菌(B3處理)顯著降低根系SS酶活性。不同處理間相比較，NaCl-B2處理中根系SPS酶活性最高，分別比CK、NaCl-CK、B1、NaCl-B1、B2、NaCl-B3、B3處理高21.46%、56.06%、26.33%、5.88%、19.51%、21.86%、22.69%。NaCl-B1處理中枸杞根系SS酶活性最高，顯著高于B1、B2、B3和NaCl-B3處理，分別比CK、NaCl-CK、B1、B2、NaCl-B2、NaCl-B3、B3處理高4.71%、9.83%、36.09%、29.33%、7.3%、60.48%、68.66%；B2處理中根系INV酶活性最高，分別比CK、NaCl-CK、B1、NaCl-B1、NaCl-B2、B3、NaCl-B3處理高4.05%、26.23%、22%、20.07%、74.57%、2.33%、55.16%。

2.6 相關(guān)性分析

2.7 主成分分析

表3 主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率、累積貢獻(xiàn)率和成分載荷矩陣Table 3 Eigenvalues, variance contribution rates, cumulative contribution rates and rotated component matrix

根據(jù)各指標(biāo)因子得分系數(shù)的矩陣，構(gòu)建6個主成分的函數(shù)表達(dá)式，隨后根據(jù)每個主成分的貢獻(xiàn)率計算得出不同處理中枸杞幼苗根系生長狀況的綜合得分，其值越大說明枸杞幼苗根系生長狀況越好，綜合評價得分結(jié)果見表4。排在前三名的為NaCl-B1、B2和NaCl-B2處理，排在最后兩名的是NaCl-B3和B3處理。

表4 不同處理下枸杞幼苗根系的各主成分得分、綜合得分(F)及優(yōu)良度排序Table 4 Principal component scores, comprehensive scores (F)， and goodness ranking of roots of Lycium barbarum seedlings under different treatment

3 討 論

根系形態(tài)是根系生長及分支的整體表現(xiàn)，除決定于遺傳因素外還受環(huán)境因素影響[13]。逆境條件下，植物通過調(diào)節(jié)根系形態(tài)，包括根系數(shù)量、長度、表面積、總體積和直徑以及在土壤中的空間構(gòu)型等指標(biāo)來適應(yīng)脅迫環(huán)境，故這些指標(biāo)在一定程度上能夠反映根系的生長發(fā)育狀況。根系活力也能夠反應(yīng)植物對土壤水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，活力越強其吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)的能力越強，運輸至地上部的水分和營養(yǎng)物質(zhì)越多，則植株生長發(fā)育就愈好。鹽脅迫能夠抑制初生根伸長、側(cè)根形成及其重力生長，導(dǎo)致根系生長發(fā)育發(fā)生變化[23]。Fan等[24]研究發(fā)現(xiàn)，鹽分脅迫顯著降低草莓根的干重、表面積、體積和根尖數(shù)等指標(biāo)；劉少華等[13]研究指出，低鹽濃度使水稻幼苗根系的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、數(shù)量、長度、總體積和根系活力均有所增加；而高鹽濃度使其明顯降低。本研究表明，枸杞幼苗主要通過減小根系總長度和增加平均直徑來適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。雖然根系總長度的降低可能引起根系對土壤中水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力減弱，但根系直徑的增加彌補了根系對水分的吸收和養(yǎng)分的供應(yīng)。同時，解鉀菌對根系形態(tài)參數(shù)的影響隨土壤環(huán)境不同而表現(xiàn)不同。非鹽脅迫下，B1和B2單菌均能增加枸杞幼苗根系總長度、投影面積和表面積，但降低根系平均直徑和根尖數(shù)；B2顯著增加根系總體積，而B1卻使根系體積有所下降。鹽脅迫下，B1單菌使枸杞幼苗根系總長度增加了3.8%，B2單菌使枸杞幼苗根系投影面積、表面積和體積分別增加了12.5%、111.0%、43.3%，且B2單菌處理中枸杞幼苗的根系活力分別是NaCl-ck和ck處理的1.66倍和1.32倍；但B1與B2的混菌不僅無助于枸杞根系總長度、投影面積、表面積、體積和平均直徑的增加，反而使各指標(biāo)全部顯著降低。然而，無論添加B1或B2的單菌還是其混合菌均能明顯增加枸杞幼苗根系的根尖數(shù)，尤其NaCl-B1處理中根尖數(shù)是NaCl-ck對照的5.35倍。由此可見，鹽脅迫下解鉀菌能夠通過增加枸杞幼苗根系的總長度、投影面積、表面積、體積、根尖數(shù)和根系活力緩解脅迫造成的傷害，最大限度為植株地上部器官提供水分和養(yǎng)分，減小因脅迫帶來的損失。

鹽分脅迫能夠造成植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與分解系統(tǒng)失衡，引起活性氧的大量積累，如果不能及時清除，則會引起植物細(xì)胞氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、膜系統(tǒng)、光合作用均受到破壞[25]。當(dāng)植物遭受逆境脅迫時，植物體內(nèi)SOD、CAT和POD活性迅速升高，可有效清除活性氧自由基，保護細(xì)胞免受活性氧的傷害[26]；同時，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)也能催化還原型谷胱甘肽(GSH)為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能，減少過氧化物的干擾及損害。本研究中鹽脅迫主要引起枸杞幼苗根系H2O2含量增加，但根系中SOD、 POD和CAT酶活性無明顯變化，而GSH-Px的活性有所提高，則表明枸杞根系中谷胱甘肽過氧化酶抗氧化系統(tǒng)對體內(nèi)活性氧的變化感知更敏感。大量研究表明，植物促生菌能夠顯著提高植物幼苗葉片的抗氧化酶活性，即使在鹽脅迫下，仍能提高水稻葉片的SOD、 POD和CAT酶活性[27-28]。本研究顯示，B1菌主要通過提高根系GSH-Px活性，具有更強的活性氧清除能力，從而降低活性氧對膜脂的傷害，表現(xiàn)出較好的耐鹽性；B1和B2的混合菌主要通過大幅度地降低H2O2含量，緩解活性氧對膜脂的傷害，表現(xiàn)出較好的耐鹽性。

糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以調(diào)控細(xì)胞的滲透平衡，參與胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，是植物生長發(fā)育和基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子[29]。顧秋香[30]指出鹽分脅迫使葡萄砧木貝達(dá)的可溶性糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；而3309C根系可溶性糖含量在脅迫初期未發(fā)生顯著性變化，隨著脅迫時間的推進出現(xiàn)顯著下降趨勢。本研究顯示，鹽脅迫對枸杞幼苗根系可溶性糖含量無明顯差異，則說明鹽脅迫環(huán)境中，枸杞幼苗能夠通過保持體內(nèi)的可溶性糖含量平衡來維持滲透平衡，使其具有較強的耐鹽性；而不同解鉀菌均能提高可溶性糖含量，有利于根系的生長發(fā)育。植物體內(nèi)糖積累與其相關(guān)代謝酶密切相關(guān)，其獲得同化產(chǎn)物的能力主要由庫強決定，而蔗糖代謝相關(guān)酶活性對庫強和糖卸載能力具有一定影響，進而影響植物體內(nèi)糖分的積累[31]。蔗糖代謝屬于碳代謝的分支，其關(guān)鍵酶主要有蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SS)和轉(zhuǎn)化酶(INV)，各種酶通過相互協(xié)調(diào)、相互作用為植物生命活動提供能量，但蔗糖代謝關(guān)鍵酶活性顯著受外界環(huán)境的影響[29]。鹽脅迫下，無論是添加B1或B2單菌還是其混菌均能提高枸杞幼苗根系SPS活性，促進根系中蔗糖的合成；然而，B1和B2單菌均能增強枸杞幼苗根系SS活性，但混合菌對其有負(fù)向作用，則表明添加B1和B2單菌更有助于根系體內(nèi)糖類的積累，維持細(xì)胞的滲透平衡，為根系的生長發(fā)育提供更多能量，緩解鹽脅迫的損傷。

4 結(jié) 論

本研究表明，添加解鉀菌能夠有效改善鹽脅迫下枸杞幼苗根系的生長發(fā)育，且不同解鉀菌的表現(xiàn)存在明顯差異。通過對枸杞幼苗根系17項形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)進行主成分分析得出：無論是否鹽脅迫，添加B1或B2單菌種效果優(yōu)于其混合菌種，其中鹽脅迫下，接種B1解鉀菌更有利于枸杞根系的生長發(fā)育；非鹽脅迫下，接種B2解鉀菌更有利于枸杞幼苗根系的生長發(fā)育。