Pentraxin 3蛋白在乳腺癌中的表達及其臨床意義

賈圣陶，趙雅雯，王克朕，張慧鯤，谷峰，馬勇杰

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院1.腫瘤細胞生物學實驗室，2.乳腺病理科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津 300060）

腫瘤的發(fā)生與進展是一個復雜的過程，是細胞與細胞微環(huán)境中多種成分間相互作用的結(jié)果，目前越來越多的研究表明，細胞微環(huán)境中炎癥因子在腫瘤中發(fā)揮重要作用。炎癥因子在炎癥部位的持續(xù)存在引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)誘導細胞增殖、趨化炎癥細胞聚集，增加活性氧產(chǎn)物的產(chǎn)生，導致DNA氧化損傷、修復程序紊亂，最終導致細胞癌變[1-2]。五聚蛋白3（PTX3）是一種存在于體液中的以環(huán)狀多聚體結(jié)構(gòu)為特征的炎癥因子，可引起補體活化[3]，是一種重要的天然免疫和炎癥生物標志物[4]，并且在多種腫瘤的發(fā)生、血管生成、轉(zhuǎn)移和癌癥免疫等方面發(fā)揮重要作用。PTX3蛋白是肺癌患者總生存的獨立預后因素，其高表達患者生存期較短[5]。此外，PTX3的高表達可以促進宮頸癌的肺轉(zhuǎn)移以及胃癌骨轉(zhuǎn)移[6-7]。PTX3還能夠促進腎細胞癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤等多種腫瘤細胞的遷移、侵襲[8-10]。

乳腺癌是目前中國乃至世界范圍內(nèi)影響女性生命健康的主要惡性腫瘤之一[11]，現(xiàn)階段乳腺癌的治療已取得一定效果，但仍需要探索參與乳腺癌惡性進展過程的關(guān)鍵分子，從而實現(xiàn)乳腺癌患者的精準治療。炎癥因子PTX3在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，但其在乳腺癌中的作用研究仍處于初始階段。Choi等[12]發(fā)現(xiàn)PTX3在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中高表達，其可促進破骨細胞的分化促進骨轉(zhuǎn)移。PTX3高表達可以促進乳腺癌細胞干性及EMT過程[13-14]。同時，Thomas等[15]分析數(shù)據(jù)庫資料發(fā)現(xiàn)，PTX3高表達的患者預后差。Scimeca等[16]通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)PTX3表達水平與乳腺癌腫瘤惡性程度正相關(guān)，其在低分化侵襲性乳腺癌中高表達，且PTX3高表達的患者預后較差。關(guān)于PTX3的研究主要集中在細胞水平，需要更多臨床研究的相關(guān)證據(jù)，因此筆者開展本項研究。鑒于乳腺浸潤性導管癌是乳腺癌最常見的類型（約占患者的80%），為了保證患者的一致性[17]，本研究選取309例乳腺浸潤性導管癌患者的石蠟標本，首次通過免疫組化染色檢測較大量乳腺癌臨床樣本中PTX3蛋白的表達情況并探究其對乳腺癌患者預后的影響。

1 資料與方法

1.1 研究資料 隨機選擇309例2004—2012年天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院收治的乳腺浸潤性導管癌（IDC）患者，平均年齡為51.8歲，納入標準：（1）均經(jīng)病理學確診。（2）患者均為女性。（3）術(shù)前未接受放化療等抗腫瘤治療。同時從309例患者中隨機選擇了33例乳腺癌患者的癌旁組織作為對照，利用石蠟標本進行PTX3的免疫組織化學染色。

1.2 免疫組化染色 將挑選出的石蠟標本切片，厚度為4 μm左右，并進行以下步驟：（1）通過二甲苯及不同濃度乙醇對組織進行脫蠟復水。（2）檸檬酸鹽高壓修復2 min 30 s。（3）3%H2O2封閉組織切片上的過氧化物酶，室溫靜置25 min。（4）山羊血清室溫封閉25 min。（5）滴加使用一抗稀釋液稀釋的PTX3抗體（1：75，Santa，SC-373951），4℃過夜孵育。（6）次日復溫50 min后，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育20 min。（7）滴加鏈霉素-過氧化物酶溶液，37℃孵育20 min。（8）用現(xiàn)配制的DAB溶液顯色，在顯微鏡下實時控制顯色狀態(tài)，所有切片顯色時長均為3 min 30 s，于清水中終止顯色。（9）蘇木精復染5 min，鹽酸酒精分化1 s，于1%氨水中返藍約3 s，晾干后使用中性樹膠封片，萊卡萬能正置顯微鏡觀察評分。

免疫組化的評分結(jié)果由兩位專業(yè)的病理醫(yī)師獨立評分得出，采用H得分評分標準，綜合考慮腫瘤細胞著色強度和面積來計算染色總分數(shù)。將腫瘤細胞染色強度分為4個等級：0（-）陰性、1（+）弱陽性、2（++）中陽性，3（+++）強陽性；腫瘤細胞面積百分比為0~100，根據(jù)H得分（強度乘以百分比）計算染色總分值，理論分數(shù)范圍為0~300分。根據(jù)PTX3得分中位值（140分）將309例IDC患者分為高、低表達組，評分小于等于140分為低表達組，大于140分為高表達組。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料比較使用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman’s Rank相關(guān)性檢驗，Kaplan-Meier分析患者的預后情況，Cox比例風險回歸模型進行單因素與多因素分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PTX3蛋白在乳腺癌和癌旁組織中的表達 圖1為PTX3在乳腺癌及癌旁組織中的不同表達強度的代表性圖片，分別為：（-）陰性、（+）弱陽性、（++）中陽性、（+++）強陽性。PTX3蛋白的表達水平在癌組織中顯著高于癌旁組織（χ2=35.3，P<0.001），如表1、圖2所示。

圖1 PTX3免疫組化染色結(jié)果Fig 1 Immunohistochemical staining results of PTX3

圖2 PTX3在乳腺癌與癌旁組織中的表達情況Fig 2 Expression of PTX3 in breast cancer and adjacent tissues

表1 乳腺癌和癌旁組織中PTX3蛋白的表達情況[n（%）]Tab 1 Expression of PTX3 in breast cancer and adjacent tissues[n（%）]

2.2 PTX3蛋白表達與IDC患者病理特征的關(guān)系 通過Spearman秩相關(guān)檢驗對PTX3的表達水平與數(shù)據(jù)資料間進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，PTX3蛋白的表達水平與乳腺癌組織學級別正相關(guān)（r=0.139，P=0.016）；與患者年齡（r=0.047，P=0.414）、腫瘤大?。╮=-0.049，P=0.396）、ER狀態(tài)（r=-0.105，P=0.067）、PR狀態(tài)（r=0.106，P=0.064）、HER2狀態(tài)（r=-0.004，P=0.948）以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)（r=-0.061，P=0.331）均無明顯相關(guān)性，如表2所示。

表2 PTX3蛋白表達水平與IDC患者臨床病理學參數(shù)的關(guān)系[n（%）]Tab 2 Relationship between PTX3 and clinicopathological parameters in IDC patients[n（%）]

進一步分析PTX3蛋白在不同級別的IDC患者中的表達情況，結(jié)果顯示，在組織學級別為Ⅰ級和Ⅱ級的患者中，PTX3蛋白表達平均得分為153.2分，在Ⅲ級及Ⅳ級患者中平均得分為169.2分（圖3），表明PTX3蛋白在高組織學級別的乳腺癌組織中高表達（t=2.035，P＜0.05）。

圖3 PTX3在不同組織學級別乳腺癌中的表達情況Fig 3 The expression of PTX3 in breast cancer of different histological grades

2.3 PTX3蛋白表達對乳腺癌患者預后的影響Kaplan-Meier生存分析顯示：PTX3高表達組的患者總生存期顯著低于PTX3低表達組（χ2=5.708，P=0.017，圖4A），無進展生存期也顯著低于PTX3低表達組（χ2=4.958，P=0.026，圖4B）。運用Cox比例風險回歸模型進行單因素分析，并將單因素分析結(jié)果中P＜0.1的多個危險因素納入到多因素Cox回歸模型中進行分析，結(jié)果表明：PTX3蛋白表達是IDC患者總生存（HR=1.006，95%CI:1.001～1.011，P=0.021）（表3）和 無 進 展 生 存（HR=1.004，95%CI:1.000～1.008，P=0.042）的獨立預后因素（表4）。

表3 IDC患者總生存的單因素和多因素分析Tab 3 Univariate and multivariate analysis of overall survival in patients with IDC

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，據(jù)估計全世界每年所有新診斷出的癌癥患者中有10%為乳腺癌患者[11]，探究乳腺癌進展中的關(guān)鍵分子，可以提供有價值的預后信息以及靶點治療新思路。PTX3是一種進化中保守的體液模式識別分子（PRM），在先天免疫中發(fā)揮重要作用。在炎癥反應(yīng)中，PTX3可激活效應(yīng)子發(fā)揮功能，在損傷以及細胞外基質(zhì)的形成和重塑中具有復雜的調(diào)節(jié)作用[3]。多項研究表明PTX3可能是癌癥相關(guān)炎癥的標志物，與多種癌癥的預后相關(guān)[5-7，18]，是體內(nèi)先天免疫、炎癥、組織修復和癌癥等過程的關(guān)鍵組分。

在本研究中，通過對309例乳腺癌患者癌組織及33例癌旁組織免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，PTX3蛋白在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。以往研究表明PTX3在多種腫瘤中高表達并發(fā)揮促癌作用。在頭頸癌中，表皮生長因子（EGF）通過磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和核因子（NF）-κB通路上調(diào)PTX3表達，EGF誘導c-Jun與PTX3啟動子上的AP1位點結(jié)合，在NF-κB的協(xié)同下上調(diào)PTX3表達，促進腫瘤細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[19]；體外實驗發(fā)現(xiàn)在基底樣乳腺癌中，NF-κB、Wnt/β-catenin、JNK-Jun信號通路的激活均能夠上調(diào)PTX3蛋白表達進而增強乳腺癌細胞干性、EMT、細胞遷移和侵襲[13-14]。由此推測，PTX3在乳腺癌組織中的高表達可能與PI3K-Akt、NF-κB、Wnt/β-catenin、JNK-Jun通路相關(guān)，需進一步驗證。

臨床病理資料分析結(jié)果表明，PTX3高表達患者總生存期及無進展生存期均較短，單因素與多因素分析表明PTX3可以作為乳腺癌的獨立預后因素，即PTX3高表達患者預后差。但PTX3在乳腺癌中發(fā)生、發(fā)展的作用機制尚未明確。以往研究發(fā)現(xiàn)：在黑色素瘤中，腫瘤細胞自分泌產(chǎn)生的PTX3會激活I(lǐng)KK/NF-κB信號通路，從而促進EMT因子TWIST1誘導的遷移侵襲[8]。在膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，PTX3蛋白高表達可以促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移，敲除PTX3后，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-2和MMP-9的表達下調(diào)，使膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲受到抑制。同時，動物學實驗表明，敲除PTX3基因抑制體內(nèi)異種移植瘤的生長[20-21]。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)，在BLBC細胞系中過表達PTX3可以激活Hedgehog信號通路和Yes相關(guān)蛋白（YAP）信號通路。Hedgehog信號通路在控制細胞增殖、組織形成、干細胞維持和發(fā)育中具有重要作用；YAP是Hippo通路的轉(zhuǎn)錄共激活因子，Hippo通路對調(diào)節(jié)腫瘤干性十分重要[22]。PTX3可能是通過調(diào)控Hedgehog和Hippo-YAP通路在乳腺癌中發(fā)揮促癌作用。根據(jù)以上結(jié)果筆者推測，PTX3可能通過NF-κB抑制蛋白激酶（IKK）/NF-κB、Hedgehog和Hippo-YAP通路參與調(diào)控腫瘤細胞的遷移、侵襲、EMT以及細胞干性，從而促進乳腺癌的惡性進展。關(guān)于PTX3的具體作用機制還需要通過細胞功能學實驗進一步證實。

綜上所述，筆者通過統(tǒng)計分析臨床病理資料發(fā)現(xiàn)PTX3蛋白在乳腺癌組織中高表達且與患者組織學分級呈正相關(guān)；PTX3蛋白是乳腺癌患者總生存期與無進展生存期的獨立預后因子，其高表達患者預后差。筆者推測，PTX3蛋白在乳腺癌中的高表達可能受PI3K-Akt、NF-κB、Wnt/β-catenin、JNK-Jun等通路的調(diào)節(jié)，然后通過Hedgehog、Hippo-YAP等信號通路調(diào)控乳腺癌EMT、細胞干性、細胞遷移、侵襲等生物學特性進而促進乳腺癌的惡性進展。