阿卡地新對冠心病大鼠AMPK/FOXO1信號通路及心功能損害的影響

王書飛，劉蕾，杜林翔，張培培，左艷芳，逯黨輝

（1.河南省周口市中心醫(yī)院心臟及內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)室，周口 466000；2.河南省人民醫(yī)院血管外科，鄭州 450000）

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是一種常見的心臟病，在世界范圍內(nèi)具有很高的死亡率和致殘性。CHD的基本病理生理過程是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS），容易形成斑塊并阻塞血管，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死[1]。炎癥[2]、氧化應(yīng)激[3]和血脂代謝異常[4]引起的AS是導(dǎo)致CHD發(fā)生、發(fā)展的重要原因，對其調(diào)控也成為臨床治療CHD的重要干預(yù)環(huán)節(jié)。目前，CHD的治療方法主要包括冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）和冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)（coronary artery bypass grafting，CABG），然而術(shù)后再狹窄和具有廣泛病變的患者限制了其在CHD中的應(yīng)用[5]。因此，迫切需要尋找一種非侵入性的方法來保護(hù)缺血性心肌。AMP活化蛋白激酶（adenosine monophosphate protein kinase，AMPK）在內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）、肝臟和大腦等多種組織廣泛表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)在局部缺血或缺氧中，AMPK的激活可促進(jìn)血管生成，抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌組織[6]，但其機(jī)制尚未完全了解。阿卡地新是AMPK特異性激動(dòng)劑[7]，可促進(jìn)AMPK磷酸化，改善心肌能量代謝，減輕體外循環(huán)術(shù)后心肌缺血再灌注損傷[8]；激活A(yù)MPK通路可保護(hù)冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能，對大鼠CHD具有一定的治療作用[9]。故推測阿卡地新作為AMPK特異性激動(dòng)劑可能對CHD大鼠心功能具有保護(hù)作用，本研究通過構(gòu)建CHD大鼠模型，探究阿卡地對CHD大鼠心功能損害的影響及其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級健康Sprauge-Dawley（SD）雄性大鼠72只，體重（210±10）g，購自濟(jì)南朋悅動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)證號為SCXK（魯）20140007，動(dòng)物飼養(yǎng)許可證：SYXK（豫），動(dòng)物批號：20150005。所有動(dòng)物均嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為（24±2）℃，濕度為50%～60%，12 h明暗交替，自由飲水和攝食。

1.2 藥品及試劑 阿卡地新（加拿大StressMarq，貨號：SIH-402，純度：≥98%）；鹽酸地爾硫卓注射液（山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20070254，10 mL:10 mg）；垂體后葉素（南京新百藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H32026638，1 mL:6單位）；HE染色試劑、RIPA裂解液和BCA試劑盒（碧云天生物科技公司，批號分別為C0105、P0013B、P0012S）；SMT100V便攜式全自動(dòng)動(dòng)物生化分析儀（江蘇南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司）；超高分辨率小動(dòng)物彩色多普勒超聲實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)（Vevo 2100，加拿大VisualSonics公司）；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、低密度脂蛋白-膽固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為A032-1、E006-11、A001-3、A003-1、A007-1、A113-1）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（RA20035）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）（RA20607）ELISA檢測試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；兔抗AMPK抗體（ab207442）、兔抗p-AMPK抗體（ab23875）、兔抗FOXO1抗體（ab179450）、兔抗p-F OXO1抗體（ab131339）、兔抗beta Actin抗體（ab8227）、羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718），購自英國abcam公司；多功能酶標(biāo)儀（iMark680，Bio-Rad公司）、熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分組與CHD模型的制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將72只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、地爾硫卓組（1.0 mg/kg）[10]、阿卡地新高、中、低劑量組（2.0、1.0、0.5 mg/kg）[11]，每組12只。除正常組外，其余各組大鼠參照文獻(xiàn)[12-13]采用高脂飼料喂養(yǎng)+腹腔注射垂體后葉素建立CHD模型，給予高脂飼料喂養(yǎng)8周后腹腔注射垂體后葉素（30 μg/kg），1次/24 h，連續(xù)注射3次，構(gòu)建CHD大鼠模型。正常組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8周后連續(xù)3 d腹腔注射等量生理鹽水。高脂飼料：基礎(chǔ)飼料81.3%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽固醇3%、膽酸鈉0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%。8周后采集大鼠尾靜脈血，用自動(dòng)生化分析儀檢測TG、TC、LDL-C驗(yàn)證建模結(jié)果：結(jié)果顯示模型大鼠TG、TC、LDL-C水平均顯著升高，模型制備成功。

1.3.2 給藥方法 地爾硫卓組、阿卡地新各劑量組在造模完成后，腹腔注射相應(yīng)劑量的阿卡地新，正常組和模型組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)注射14 d。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 心功能檢測 末次注射阿卡地新2 h后，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采用超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)測量大鼠左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF），短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）。

1.4.2 心肌酶及炎性指標(biāo)檢測 心功能檢測完成后，腹主動(dòng)脈取血，靜置后以3 000 r/min離心15 min，分離血清，檢測血清中CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作。

1.4.3 脂代謝指標(biāo)檢測 生化法檢測血清TC、TG、LDL-C水平，溶液的配置及檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取血后，取出大鼠完整心臟，于冰上用無菌手術(shù)刀片切分為3部分，一部分置于凍存管中，-80℃保存；一部分用4%多聚甲醛固定；另一部分按照1:9加入預(yù)冷的生理鹽水研磨后，離心，取上清液，制備成10%的組織勻漿，生化法檢測勻漿中MDA、SOD、CAT水平。

1.4.5 心肌組織HE染色 取4%多聚甲醛固定的心肌組織，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，連續(xù)切3 μm薄片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯1 min，蒸餾水沖洗。常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心臟組織形態(tài)變化。

1.4.6 Western印跡法檢測心肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá) 取-80℃冰箱保存的心肌組織，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白溶液。用BCA法測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（30 μg/孔）上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)一抗（AMPK、p-AMPK、FOXO1、p-FOXO1按照1∶1 000比例進(jìn)行稀釋，β-actin 1∶5 000按比例進(jìn)行稀釋）于4℃下孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究所得數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以±s表示，當(dāng)符合正態(tài)分布和同質(zhì)性時(shí)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey事后檢驗(yàn)，組間有差異進(jìn)一步采用SNK-q檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿卡地新對CHD大鼠心功能的影響 與正常組相比，模型組大鼠LVESD、LVEDD顯著增大，EF、FS顯著下降（均P＜0.05）；與模型組相比，地爾硫卓組。阿卡地新高、中劑量組大鼠LVESD、LVEDD明顯下降，EF、FS明顯升高（均P＜0.05）；與地爾硫卓組相比，阿卡地新高劑量組LVESD、LVEDD、EF、FS差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 阿卡地新對CHD大鼠心功能的影響（±s）Tab 1 Effect of Acadixin on cardiac function in CHD rats（±s）

表1 阿卡地新對CHD大鼠心功能的影響（±s）Tab 1 Effect of Acadixin on cardiac function in CHD rats（±s）

注：CHD：冠心?。籐VESD：左心室收縮末期內(nèi)徑；LVEDD：左心室舒張末期內(nèi)徑；EF：射血分?jǐn)?shù)；FS：短軸縮短率；與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與地爾硫卓組相比，cP＜0.05

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2.2 阿卡地新對CHD大鼠血清心肌酶及炎性相關(guān)因子的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平顯著升高（均P＜0.05）；與模型組相比，地爾硫卓組、阿卡地新高、中、低劑量組大鼠血清CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平明顯下降（均P＜0.05）；與地爾硫卓組相比，阿卡地新高劑量組CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 阿卡地新對CHD大鼠心肌酶及炎性相關(guān)因子的影響（±s）Tab 2 Effect of Acadixin on myocardial enzymes and inflammatory related factors in CHD rats（±s）

表2 阿卡地新對CHD大鼠心肌酶及炎性相關(guān)因子的影響（±s）Tab 2 Effect of Acadixin on myocardial enzymes and inflammatory related factors in CHD rats（±s）

注：CHD：冠心?。籆K：肌酸激酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶-MB；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細(xì)胞介素-6；與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與地爾硫卓組相比，cP＜0.05

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2.3 阿卡地新對CHD大鼠脂代謝相關(guān)指標(biāo)的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高（均P＜0.05）；與模型組相比，地爾硫卓組和阿卡地新高、中劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯下降（均P＜0.05）；與地爾硫卓組相比，阿卡地新高劑量組TC、TG、LDL-C水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表3 阿卡地新對CHD大鼠脂代謝相關(guān)指標(biāo)的影響（±s）Tab 3 Effect of Acadixin on related indexes of lipid metabolism in CHD rats（±s）

表3 阿卡地新對CHD大鼠脂代謝相關(guān)指標(biāo)的影響（±s）Tab 3 Effect of Acadixin on related indexes of lipid metabolism in CHD rats（±s）

注：CHD：冠心病；TG：甘油三酯；TC：總膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白-膽固醇；與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與地爾硫卓組相比，cP＜0.05

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2.4 阿卡地新對CHD大鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與正常組相比，模型組大鼠心肌組織SOD、CAT水平顯著降低，MDA水平顯著升高（均P＜0.05）；與模型組相比，地爾硫卓組和阿卡地新高、中、低劑量組大鼠心肌組織SOD、CAT水平明顯升高，MDA水平明顯降低（均P＜0.05）；與地爾硫卓組相比，阿卡地新高劑量組SOD、CAT、MDA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表4。

表4 阿卡地新對CHD大鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s）Tab 4 Effect of Acadixin on oxidative stress index of myocardial tissue in CHD rats（±s）

表4 阿卡地新對CHD大鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s）Tab 4 Effect of Acadixin on oxidative stress index of myocardial tissue in CHD rats（±s）

注：CHD：冠心??；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；CAT：過氧化氫酶；與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與地爾硫卓組相比，cP＜0.05

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2.5 阿卡地新對CHD大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化的影響HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠的心肌細(xì)胞排列整齊、心肌纖維結(jié)構(gòu)完整清晰，染色均勻，未見心肌細(xì)胞水腫、壞死；模型組大鼠心肌組織染色不均，局部肌纖維橫紋消失，心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，可見水腫變性，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤；與模型組相比，地爾硫卓組和阿卡地新高、中劑量組大鼠心肌細(xì)胞水腫減輕，心肌纖維排列較為整齊，纖維斷裂減少，少量炎性細(xì)胞浸潤，見圖1。

圖1 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變(HE染色，200×)Fig 1 Morphological changes of myocardial tissue in rats(HE staining,200×)

2.6 阿卡地新對CHD大鼠心肌組織中p-AMPK/AMPK、p-FOXO1/FOXO1表達(dá)的影響Western印跡結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織p-AMPK/AMPK、FOXO1蛋白表達(dá)顯著降低，p-FOXO1蛋白表達(dá)顯著升高（均P＜0.05）；與模型組相比，地爾硫卓組和阿卡地新高、中劑量組大鼠心肌組織p-AMPK/AMPK、FOXO1蛋白表達(dá)明顯增加，p-FOXO1蛋白表達(dá)明顯降低（均P＜0.05）；與地爾硫卓組相比，阿卡地新高劑量組p-AMPK/AMPK、FOXO1、p-FOXO1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2。

圖2 阿卡地新對CHD大鼠心肌組織AMPK、FOXO1蛋白表達(dá)的影響Fig 2 The effect of acarbose on the expression of AMPK and FOXO1 protein in myocardium of CHD rats

3 討論

炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)和血脂代謝異常在CHD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[14]。當(dāng)心肌缺血時(shí)，機(jī)體代謝產(chǎn)物不能被及時(shí)清除，在體內(nèi)大量堆積產(chǎn)生毒性作用，誘發(fā)心肌發(fā)生病變，導(dǎo)致心泵功能減退，血液流變學(xué)發(fā)生異常，引起血脂代謝異常；同時(shí)心肌缺血后會(huì)激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），生成和釋放大量炎性因子（如TNF-α、IL-6），促進(jìn)CHD的發(fā)生、發(fā)展。高脂飲食被認(rèn)為是誘發(fā)脂代謝紊亂并導(dǎo)致CHD的必不可少的因素[12]。因此，本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射垂體后葉素構(gòu)建CHD大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型大鼠LVESD、LVEDD顯著升高，EF、FS顯著下降，提示CHD大鼠心腔擴(kuò)大，心臟泵血量顯著降低，不能滿足機(jī)體的需要，心臟泵血功能衰竭；CHD大鼠血清CKMB、CK水平顯著升高，HE染色結(jié)果也顯示，心肌組織染色不均，局部肌纖維橫紋消失，心肌細(xì)胞排列紊亂，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤；說明CHD大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌損傷；同時(shí)血清炎癥和脂代謝相關(guān)指標(biāo)水平顯著升高，且心肌抗氧化指標(biāo)（SOD、CAT）水平的顯著降低，MDA水平的升高；提示CHD大鼠出現(xiàn)血脂代謝異常、炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

阿卡地新是一種腺苷類似物，能夠模擬AMP功能，特異性激活A(yù)MPK。AMPK是一種位于真核生物細(xì)胞中廣泛表達(dá)且高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對炎癥和氧化應(yīng)激具有重要調(diào)節(jié)作用[15]；提高AMPK活性，可降低ROS水平，增加SOD生成，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[16]。而且AMPK通路可調(diào)控脂類代謝，研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可通過激活A(yù)MPK通路，抑制脂肪酸合成，增加血脂中脂肪酸的氧化，降低血脂水平，調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，預(yù)防冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展[17]。阿卡地新能降低心肌細(xì)胞中ROS、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）水平，調(diào)節(jié)心肌梗死后心肌功能[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予阿卡地新干預(yù)后，大鼠LVESD、LVEDD明顯降低，EF、FS明顯升高，提示CHD模型大鼠心臟泵血功能明顯改善；血清CKMB、CK水平明顯降低，心肌損傷減輕，同時(shí)血清炎癥因子（TNF-α、IL-6）、脂代謝相關(guān)指標(biāo)（TC、TG、LDL-C）水平明顯降低，心肌組織SOD、CAT水平明顯升高，說明阿卡地新可抑制CHD模型大鼠的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善血脂代謝異常。

FOXO1是Fox家族成員之一，大量證據(jù)表明FOXO1是心臟代謝調(diào)節(jié)和維持心臟功能的重要因素，AMPK/FOXO1信號通路的激活具有心臟保護(hù)作用。FOXO1主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，但FOXO1的核定位是該基因調(diào)節(jié)功能的前提。在磷酸化狀態(tài)，F(xiàn)OXO1被排除在細(xì)胞核之外，并以泛素依賴性方式在細(xì)胞質(zhì)中降解。而AMPK激活后可直接阻止FOXO1的磷酸化，觸發(fā)FOXO1蛋白從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的重新定位，并使FOXO1活性增加，降低細(xì)胞中活性氧的水平[19]；還可以增加脂肪酸β氧化，增強(qiáng)脂肪細(xì)胞的脂解作用，降低肌管中的脂質(zhì)蓄積[15]。絞股藍(lán)皂甙A可通過激活A(yù)MPK/FOXO1途徑，保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷[20]。作為AMPK的特異性激活劑，阿卡地新對CHD大鼠的保護(hù)機(jī)制是否與FOXO1有關(guān)？本研究采用Western印跡法檢測了AMPK、FOXO1及其磷酸化蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示阿卡地新可明顯增加心肌組織p-AMPK/AMPK、FOXO1蛋白的表達(dá)，降低p-FOXO1蛋白表達(dá)；提示阿卡地新對CHD大鼠的心功能的保護(hù)作用，可能與激活A(yù)MPK/FOXO1信號通路有關(guān)。

綜上所述，阿卡地新可抑制CHD大鼠的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善血脂代謝異常，保護(hù)心功能；其作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/FOXO1信號通路有關(guān)。本研究為CHD的治療和阿卡地新的臨床應(yīng)用提供了理論與實(shí)驗(yàn)參考，但尚存在一定不足，未設(shè)置通路抑制劑組進(jìn)行驗(yàn)證，此外，由于條件限制，本研究只在動(dòng)物水平進(jìn)行了驗(yàn)證，下一步可從細(xì)胞水平上進(jìn)行探討。