miR-133過表達對結(jié)腸癌細胞SW480凋亡、增殖和裸鼠成瘤的影響

潘瓊，谷見法，劉松格，楊曉瑞，易善永

（鄭州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，鄭州 450000）

結(jié)腸癌是一種常見的胃腸道腫瘤，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和與癌癥相關(guān)的死亡率中位居前例[1]。相關(guān)研究表明，癌基因的激活和抑癌基因的失活對結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用[2]。盡管在診斷和治療上有很大進步，但其發(fā)病機制尚未完全明了。因此，需要進一步探尋結(jié)腸癌的關(guān)鍵分子機制，為結(jié)腸癌患者開發(fā)更有效的療法。MicroRNAs（miRNAs）是一類長度約為19～24 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過靶向靶基因3′-UTR的堿基互補配對結(jié)合，引起轉(zhuǎn)錄抑制或調(diào)節(jié)mRNA降解，從而在植物和動物中發(fā)揮重要作用[3]。miRNA控制并參與多種細胞過程的基因表達，包括炎癥、代謝、增殖和細胞凋亡[4]。已有研究表明miR-133在肺癌、胃癌、膀胱癌和前列腺癌中表達下調(diào)，miR-133過表達抑制癌細胞的惡性行為，提示其可能是阻斷癌癥進展的靶點[5-8]。但目前miR-133在結(jié)腸癌進程中的作用和潛在機制尚不完全清楚，相關(guān)研究很少，本文旨在探究miR-133過表達對結(jié)腸癌細胞SW480凋亡、增殖和裸鼠成瘤的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基（61870-127）、胎牛血清（26400-036）、青-鏈霉素（15140-122）和胰蛋白酶（25200-056）均購自美國Gibco公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（A0208）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0012S）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（C1062S）、CCK-8試劑盒（C0037）購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、Caspase-3（ab13847）、cleaved Caspase-3（ab2302）、Caspase-9（ab52298）、cleaved Caspase-9（ab2324）、c-Myc（ab39688）、GAPDH（ab9485）單克隆抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌SW480細胞株來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC），置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素）培養(yǎng)，每3 d傳代1次，收集細胞時用0.25%胰蛋白酶消化，實驗選用對數(shù)生長期細胞。

1.3 細胞處理及分組 將SW480細胞接種于6孔板（1×105個/孔），待60%融合度時更換為無血清培養(yǎng)基。采用LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑將Scramble和miR-133 mimic轉(zhuǎn)染至SW480細胞，細胞分組為：對照組、Scramble組和miR-133 mimic組。

1.4 RT-PCR檢測miR-133表達 用Trizol法從各組SW480細胞中提取總RNA，采用PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應(yīng)體系，miR-133上游引物：5′-TTTGGTCCCCTTCAACC-3′，下游引物：5′-GAGCAGGGTCCGAGGT-3′。反應(yīng)條件為：95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，45個循環(huán)，72℃10 min。miR-133的相對表達使用公式2-ΔΔCt計算。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 胰蛋白酶消化并收集SW480細胞到10 mL的離心管中，每樣本細胞數(shù)為3×106/mL，1 500 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液洗滌1次，1 500 r/min離心5 min，重懸細胞后室溫避光孵育15 min，加入10 μL Annexin V-FITC后避光孵育10 min，加入10 μL碘化丙啶避光孵育30 min后，通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.6 Western印跡檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表達水平 取各組對數(shù)生長期SW480細胞裂解提取總蛋白，通過BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。取等量蛋白質(zhì)樣品100℃變性5 min后用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，在4℃條件下加入Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9和c-Myc一抗（1∶1 000）并孵育過夜，PBST清洗3次，4℃下加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1∶5 000），孵育1 h，最后加入ECL發(fā)光液曝光拍照。以GAPDH為內(nèi)參，目的條帶灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白表達水平。

1.7 CCK-8檢測細胞增殖倍數(shù) 收集各組SW480細胞，接種至96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃下培養(yǎng)4 d，于第24、48、72、96小時檢測450 nm處吸光度值計算細胞增殖倍數(shù)。

1.8 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成率 在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)SW480細胞4 d，接種至6孔板，每孔約500個細胞，培養(yǎng)14 d，用4%多聚甲醛固定30 min，0.5%結(jié)晶紫染色，PBS清洗后拍照觀察細胞克隆形成數(shù)目，計算細胞克隆形成率。細胞克隆形成率=細胞克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.9 結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型10只30日齡雄性Balb/c裸鼠購自北京維通利華動物科技有限公司，體重（20±2）g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0009，在特定的無病原體條件下飼養(yǎng)。取方法1.3對照組和miR-133 mimic組細胞用PBS將細胞密度調(diào)至1×107/mL，于裸鼠右側(cè)腋窩處皮下注射0.2 mL細胞懸液，將裸鼠隨機分為2組：對照組和miR-133 mimic組。第28天處死所有裸鼠，檢測裸鼠腫瘤重量，RT-PCR檢測裸鼠腫瘤miR-133表達水平。

1.10 免疫組化檢測Caspase-3、Ki67陽性細胞數(shù) 取各組裸鼠腫瘤組織，常規(guī)石蠟包埋切片，厚度約為4 μm，按免疫組化檢測試劑盒說明書對各組裸鼠腫瘤組織進行免疫組化染色，DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分色，光學(xué)顯微鏡觀察Caspase-3、Ki67在腫瘤組織中的表達情況。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理 使用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料表示為±s，組間比較采取SNK-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SW480細胞轉(zhuǎn)染miR-133 mimic通過RTPCR檢測miR-133表達水平，結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，miR-133 mimic組miR-133表達顯著升高（F=136.70，P＜0.05）。

圖1 SW480細胞轉(zhuǎn)染miR-133 mimicFig 1 SW480 cells transfected with miR-133 mimic

2.2 miR-133過表達對SW480細胞凋亡的影響 通過流式細胞儀檢測各組SW480細胞凋亡率，結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，miR-133 mimic組細胞凋亡率顯著升高（F=59.995，P＜0.05）。

2.3 miR-133過表達對SW480細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表達水平的影響 通過Western印跡檢測各組細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表達水平，結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，miR-133 mimic組Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9表達顯著升高（F=726.85、138.76、55.85，均P＜0.05），c-Myc蛋白表達水平顯著降低（F=88.98，P＜0.05）。

注：與對照組比較，*P＜0.05

圖3 miR-133過表達對SW480細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表達水平的影響Fig 3 Effects of miR-133 overexpression on the expression of Bcl-2，Bax，Caspase-3，Caspase-9 and c-Myc in SW480 cells

2.4 miR-133過表達對SW480細胞活力的影響 通過CCK-8法檢測各組細胞活力，結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，miR-133 mimic組細胞活力顯著降低（F=48.50，P＜0.05）。

注：與對照組比較，*P＜0.05

2.5 miR-133過表達對SW480細胞增殖的影響 通過克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成率如圖5所示，與對照組相比，miR-133 mimic組細胞克隆形成率顯著降低（F=42.63，P＜0.05）。

圖5 miR-133過表達對SW480細胞克隆形成率的影響（200×）Fig 5 Effect of miR-133 overexpression on the clonal formation rate of SW480 cells（200×）

2.6 miR-133過表達對結(jié)腸癌裸鼠移植瘤成瘤的影響 檢測各組裸鼠腫瘤重量如圖6A、B所示，與對照組相比，miR-133 mimic組腫瘤重量顯著降低（t=1.788，P＜0.05）；RT-PCR檢 測 各 組 裸 鼠 腫 瘤miR-133表達水平結(jié)果如圖6C所示，與對照組相比，miR-133mimic組miR-133表達水平顯著升高（t=1.043，P＜0.05）；免疫組化檢測各組裸鼠Caspase-3、Ki67陽性細胞數(shù)結(jié)果如圖6D所示，與對照組相比，miR-133 mimic組Caspase-3陽性細胞數(shù)顯著升高（t=1.167，P＜0.05），Ki67陽性細胞數(shù)顯著降低（t=1.557，P＜0.05）。

圖6 miR-133過表達對結(jié)腸癌裸鼠移植瘤成瘤的影響（200×）Fig 6 Effect of miR-133 overexpression on tumorigenesis in nude mice with colon cancer（200×）

3 討論

結(jié)腸癌是一種常發(fā)于中老年群體的惡性消化道腫瘤，主要發(fā)病部位為直腸與乙狀結(jié)腸交界處。結(jié)腸癌早期癥狀不典型，診斷困難，且多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于癌癥中晚期，導(dǎo)致預(yù)后較差。因而，迫切需要探尋早期診斷結(jié)腸癌的生物學(xué)標志物。

細胞凋亡途徑的活化是治療腫瘤最主要的方法之一。細胞凋亡分為外源性、內(nèi)源性及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑[9]。Bcl-2家族的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，升高Bax/Bcl-2比值可誘導(dǎo)細胞凋亡，降低Bax/Bcl-2比值則抑制細胞凋亡[10]。細胞質(zhì)中的Caspase-3一般無活性，并以ProCaspase-3形式存在，當細胞受到凋亡刺激時，被激活進而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，當Caspase-3活化時意味著凋亡進入不可逆階段[11]。Caspase-9是一種常見凋亡啟動因子，可通過激活下游凋亡執(zhí)行因子啟動凋亡[12]。C-myc是一種常見的原癌基因，可促進細胞增殖或誘導(dǎo)細胞凋亡，在結(jié)腸癌組織中異常高表達[13]。ZHANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-133靶向YES原癌基因1，誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細胞凋亡。許榮華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-133水平可抑制胃癌細胞的侵襲并誘導(dǎo)凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-133過表達具有升高SW480細胞Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9表達，降低c-Myc蛋白表達水平和升高結(jié)腸癌裸鼠移植瘤Caspase-3陽性表達率的作用。提示miR-133過表達通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路凋亡因子，誘導(dǎo)SW480細胞凋亡，促進結(jié)腸癌裸鼠移植瘤腫瘤細胞凋亡。

結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多基因變化的過程，從分子角度出發(fā)，抑制癌細胞增殖是治療結(jié)腸癌的基本策略[16]。Ki67在腫瘤組織中的表達強度與腫瘤細胞的增殖密切相關(guān)。已有研究表明，Ki67在結(jié)腸癌腫瘤組織中高表達[17]。彭玉平等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-13通過靶向JAK2抑制胃癌細胞增殖。胡東輝等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-133通過影響EGFR表達而抑制肝癌細胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-133過表達可降低SW480細胞克隆形成率和結(jié)腸癌裸鼠移植瘤Ki67的陽性表達率。提示miR-133過表達抑制SW480細胞和結(jié)腸癌裸鼠移植瘤腫瘤細胞增殖。

綜上所述，本研究通過過表達SW480中miR-133，觀察其對SW480細胞生物學(xué)的影響。結(jié)果證實，miR-133過表達誘導(dǎo)SW480細胞凋亡，抑制SW480細胞增殖和裸鼠腫瘤的形成。miR-133可能為結(jié)腸癌的診療提供新的依據(jù)和分子靶點。