LncRNA PTCSC3過表達(dá)誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549凋亡和氧化損傷并抑制細(xì)胞增殖和遷移

陳鴻運(yùn)，李曉明，黃國勝，楊金華，喬飛

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院普胸外科，南陽 473000）

近年來環(huán)境惡化、吸煙人數(shù)急劇上升導(dǎo)致肺癌患者逐年增加，目前非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLS）已經(jīng)成為我國最常見的肺癌之一[1]。肺癌的治療方式主要包括手術(shù)治療和藥物化療[2]。隨著科技的發(fā)展，使用長鏈非編碼RNA（long noncodingRNA，lnc RNA）基因治療成為目前研究的熱點(diǎn)，目前l(fā)ncRNA在眾多疾病中均發(fā)揮著重要的作用[3]。XIA等[4]研究表明，lncRNAPTCSC3可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲。WANG等[5]研究表明，lncRNAPTCSC3可以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。因此筆者推測lncRNAPTCSC3對肺癌A549細(xì)胞也有一定的抑制效果，但目前關(guān)于lncRNAPTCSC3對肺癌細(xì)胞的抑制研究較少，作用機(jī)制也尚不確定。因此本文旨在探究lncRNAPTCSC3對A549細(xì)胞的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料A549細(xì)胞由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；caspase-3抗體（貨號：ab32351）、caspase-9抗體（貨號：ab32539）、Ki67抗體（貨號：ab92742）、p21抗體（貨號：ab109520）、E-cadherin抗體（貨號：ab1416）、N-cadherin抗體（貨號：ab76011）購自艾博抗有限公司；凋亡檢測試劑盒（貨號：P-CA-201）購自武漢普羅塞生命科技有限公司；流式細(xì)胞儀購自BD公司；Transwell小室購自美國Corning Coseter公司；流式細(xì)胞儀（型號：CyoFLE）購自貝克曼有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 快速取出A549細(xì)胞解凍，以1 000 r/min離心5 min，將培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為37℃，CO2濃度調(diào)節(jié)為5%，將細(xì)胞放入FBS、青霉素和鏈霉素混合的RPMI1640培養(yǎng)基中，待細(xì)胞融合到90%左右時，加入1 mL的胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 pcDNA-lncRNAPTCSC3重組質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)lncRNAPTCSC3引物，使用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，待pcDNA3.1-lncRNAPTCSC3的載體建立成功后，使用內(nèi)切酶對PTCSC3基因進(jìn)行雙酶切處理，切后的產(chǎn)物應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行目的基因鑒定并將目的基因克隆到pc-DNA3.1質(zhì)粒載體上，取出冷藏的感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞和鏈接產(chǎn)物細(xì)胞于EP管中置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，使用內(nèi)切酶酶進(jìn)行質(zhì)粒重組，并對基因進(jìn)行序列對比和鑒定。

1.2.3 細(xì)胞的分組和轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞分為對照組、pcDNA組和pcDNA-lncRNAPTCSC3組；其中pcDNA-lncRNAPTCSC3組將lncRNAPTCSC3導(dǎo)入到pc-DNA3.1載體中，再根據(jù)試劑盒說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建過表達(dá)的細(xì)胞株；pcDNA組加入轉(zhuǎn)染試劑和vector瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞；對照組僅加入轉(zhuǎn)染試劑。

1.2.4 RT-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測相關(guān)基因表達(dá)量 取各組A549細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度和純度后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后PCR擴(kuò)增，逆轉(zhuǎn)錄條件：30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min；檢測各RNA表達(dá)水平，采用2-ΔΔCt法計(jì)算RNA的相對表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）為內(nèi)參。基因引物序列見表1。

表1 基因引物序列Tab 1 Primer sequences of genes

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測 收集完成離心后的A549細(xì)胞，加入100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，完成后分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI，輕輕混勻，避光下孵育15 min，完成孵育后加入400 μL Binding Buffer上機(jī)檢測。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá)水平 收集完成離心后的A549細(xì)胞，加入裂解液裂解后加入Loading Buffer緩沖液。測定蛋白濃度，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，保持在37℃的條件下，將脫脂奶粉調(diào)整濃度至5%并加入其中封閉2 h，完成封閉后加入caspase-3、caspase-9、E-cadherin和N-cadherin蛋白的抗體（稀釋比例1∶500），常規(guī)孵育。使用TBS洗凈后上機(jī)檢測，內(nèi)參蛋白選定ACTIN（稀釋比例1∶1 000），根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值相比確定為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.7 試劑盒檢測活性氧簇含量 收集完成離心后的A549細(xì)胞，使用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞，加入10 μm/L的DCF-DA，置于37℃恒溫箱中孵育20 min，洗滌后在光學(xué)顯微鏡下觀察；同時收獲細(xì)胞，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，將A549細(xì)胞濃度調(diào)至2×106/mL，使用熒光酶標(biāo)儀測525 nm處的OD值。

1.2.8 細(xì)胞增殖能力檢測 將細(xì)胞制成密度為1×103個/mL的單細(xì)胞懸液后，每孔加入0.4 mL的細(xì)胞懸液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，使用結(jié)晶紫染色，觀察細(xì)胞生長情況并計(jì)算細(xì)胞克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=（克隆數(shù)/所種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.9 細(xì)胞侵襲能力檢測 將細(xì)胞制成密度為1×105個/mL的單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞加入Transwell小室上層中，在小室下層加入正常RPMI 1640培養(yǎng)液，調(diào)整培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)24 h后擦去小室內(nèi)細(xì)胞，使用結(jié)晶紫對侵襲至小室下層的細(xì)胞進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野對細(xì)胞進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)目，本研究每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 22.0，作圖采用軟件Graph Pad Prism 5，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組lncPTCSC3的表達(dá)水平檢測結(jié)果 與對照組相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3組PTCSC3基因表達(dá)水平顯著升高（t=14.758，P<0.05），但pcDNA組PTCSC3基因表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組lnc PTCSC3的表達(dá)水平檢測結(jié)果Fig 1 Expression of lnc PTCSC3 in each group

2.2 各組A549細(xì)胞凋亡情況及相關(guān)蛋白檢測結(jié)果與對照組相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3組A549細(xì)胞凋亡率顯著升高（t=12.188，P＜0.05），但pcDNA組A549細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3組cleaved caspase-3/caspase-3蛋白和cleaved caspase-9/caspase-9蛋白相對表達(dá)水平顯著升高（t=9.905、7.320，均P＜0.05），但pcDNA組cleaved caspase-3/caspase-3蛋白和cleaved caspase-9/caspase-9蛋白相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組A549細(xì)胞凋亡情況及相關(guān)蛋白檢測結(jié)果Fig 2 Apoptosis of A549 cells and related proteins in each group

2.3 各組A549細(xì)胞活性氧簇的含量檢測結(jié)果與對照組相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3組A549細(xì)胞活性氧簇水平顯著降低（t=10.276，P＜0.05），但pcDNA組A549細(xì)胞活性氧簇水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組A549細(xì)胞活性氧簇含量檢測結(jié)果Fig 3 Contents of reactive oxygen species in A549 cells of each group

2.4各組A549細(xì)胞增殖情況及mRNA表達(dá)水平 與對照組相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3組A549細(xì)胞克隆形成率顯著降低（t=9.615，P＜0.05），但pcDNA組A549細(xì)胞克隆形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3組A549細(xì)胞中Ki67 mRNA表達(dá)水平顯著降低（t=20.444，P＜0.05），p21 mRNA表達(dá)水平顯著升高（t=13.975，P＜0.05），但pcDNA組A549細(xì)胞中Ki67 mRNA和p21 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖4。

圖4 各組A549細(xì)胞增殖情況及mRNA表達(dá)水平Fig 4 Proliferation of A549 cells and related proteins in each group

2.5 各組A549細(xì)胞侵襲情況及相關(guān)蛋白檢測結(jié)果 與對照組相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3組A549細(xì)胞單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低（t=6.576，P＜0.05），但pcDNA組A549細(xì)胞單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3組E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平顯著升高（t=7.443，P＜0.05），N-cadherin蛋白相對表達(dá)水平顯著降低（t=14.992，P＜0.05），但pcDNA組E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖5。

圖5 各組A549細(xì)胞侵襲情況及相關(guān)蛋白檢測結(jié)果Fig 5 Invasion of A549 cells and related proteins in each group

3 討論

LncRNAPTCSC3與多種腫瘤關(guān)系密切，本研究采用pcDNA-lncRNAPTCSC3將PTCSC3基因?qū)敕伟〢549細(xì)胞中，與對照組相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3組PTCSC3基因表達(dá)水平顯著升高，說明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激損傷是一種常見的細(xì)胞損傷，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷后會產(chǎn)生大量的活性氧簇，損傷細(xì)胞膜[6]。本研究檢測各組細(xì)胞的氧化物質(zhì)水平發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3組A549細(xì)胞活性氧簇含量顯著降低，證明表達(dá)PTCSC3基因?qū)549細(xì)胞氧化活性具有一定的調(diào)節(jié)作用。

細(xì)胞凋亡是指由基因調(diào)控的細(xì)胞自主性的程序性死亡，細(xì)胞主要通過細(xì)胞的凋亡調(diào)控內(nèi)環(huán)境。目前研究較多的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白家族主要包括caspase家族和Bcl-2家族。Caspase家族中caspase-3是常見的啟動者，caspase-9是常見的執(zhí)行者[7]。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號后，會激活caspase-3并將凋亡信號傳遞至caspase-9，使得caspase-9活化，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[8-9]。本研究中，與對照組相比，pcDNA-lncRNAPTCSC3組A549細(xì)胞凋亡率顯著升高，cleaved caspase-3/caspase-3蛋白和cleaved caspase-9/caspase-9蛋白相對表達(dá)水平顯著升高。說明過表達(dá)PTCSC3基因可以激活caspase家族中的凋亡起始子caspase-3，并通過其激活凋亡執(zhí)行子caspase-9，使得細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。王儉等[10]研究表明，通過A549細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

腫瘤的惡性生物學(xué)特征主要包括失控性增生、浸潤和轉(zhuǎn)移[11]。Ki67是一種與細(xì)胞增殖關(guān)系密切的增殖蛋白，其高表達(dá)表明細(xì)胞增殖加速，處于快速增殖階段[12-13]。P21是Clp家族中的一員，p21與克隆及其在細(xì)胞周期控制與腫瘤發(fā)生中有重要作用，同時也與腫瘤的分化、浸潤深度、增生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，相比對照組，pcDNA-lncRNAPTCSC3組A549細(xì)胞克隆形成率、Ki67 m RNA表達(dá)顯著降低，p21mRNA表達(dá)水平顯著升高。說明當(dāng)細(xì)胞過表達(dá)PTCSC3基因后，A549細(xì)胞中增殖相關(guān)基因Ki67受到了抑制，同時抑制了調(diào)控細(xì)胞周期的p21基因表達(dá)升高，表明腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期受到了抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞合成相關(guān)蛋白受阻，抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖過程。金文靜等[15]研究表明，調(diào)節(jié)肺癌A549中的長鏈非編碼RNA的表達(dá)可以調(diào)控腫瘤組織中Ki67的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)影響腫瘤細(xì)胞的增殖。

腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是其重要的惡性生物學(xué)特征之一，其中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchyml transition，EMT）是影響腫瘤細(xì)胞極性的重要過程，可以影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[16]。EMT過程受到相關(guān)蛋白的調(diào)控，N-cadherin是N-鈣黏蛋白，可以增強(qiáng)細(xì)胞的黏附能力，其高表達(dá)會使細(xì)胞的黏附能力增強(qiáng)，運(yùn)動能力減弱[17]。E-cadherin也是調(diào)節(jié)EMT過程的重要蛋白，當(dāng)E-cadherin減少會使間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如波形蛋白、纖連蛋白表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)EMT的細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子及輔助作用的一些酶表達(dá)上調(diào)。同時還會使得上皮細(xì)胞失去黏附連接的作用，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)松散，呈現(xiàn)梭形纖維細(xì)胞樣形態(tài)，此時細(xì)胞會獲得較強(qiáng)的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PTCSC3基因可以通過減少E-cadherin蛋白，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)松散，使得上皮細(xì)胞失去了黏附連接的作用，增強(qiáng)細(xì)胞EMT，減弱細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附性，使得A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)。

綜上所述，過表達(dá)lncRNAPTCSC3通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和相關(guān)蛋白表達(dá)水平，抑制NSCLS A549的增殖和遷移并促進(jìn)其凋亡。