基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討清胰湯治療急性胰腺炎的作用機(jī)制

王夏雨，施繼禹，賈傲，楊振偉，崔云峰

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.天津市南開醫(yī)院肝膽胰外科，天津 300100）

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是臨床中較為常見的外科急腹癥之一，具有發(fā)病急、進(jìn)展快的特點，經(jīng)常出現(xiàn)局部和全身并發(fā)癥，病情較重者可發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），甚至出現(xiàn)器官功能的衰竭[1]。目前尚沒有針對AP發(fā)病的特效藥物，治療多以對癥支持治療為主[2]。中藥因其多靶點的藥理活性特征，在治療AP的實踐中相較于西藥具有更佳的療效和預(yù)后價值[3]。清胰湯（QingyiTang，QYT）及其加減方作為全國廣泛運(yùn)用的AP治療方劑，在臨床實踐過程中療效顯著[4]?，F(xiàn)已有研究顯示QYT可通過抗凋亡、減少壞死、減輕炎癥反應(yīng)等途徑起到治療AP的作用[5]，但其具體治療靶點、作用機(jī)制仍待探索。本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，探討QYT治療AP的潛在分子機(jī)制，并對通過篩選得到的重要生物學(xué)進(jìn)程進(jìn)行實驗驗證，以期為QYT治療AP的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 建立QYT化合物數(shù)據(jù)庫 通過BATMANTCM中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫，依次檢索QYT全方中藥（柴胡、黃芩、延胡索、黃連、木香、白芍、大黃、芒硝）化學(xué)成分。根據(jù)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中藥物動力學(xué)參數(shù)，得到活性成分作為候選化合物及靶點。去重后得到與有效成分關(guān)聯(lián)的靶點1 853種，構(gòu)建QYT化合物數(shù)據(jù)庫。

1.2 AP預(yù)測靶點的篩選 通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“acute pancreatitis”為關(guān)鍵詞檢索，篩選收集AP相關(guān)靶點，并將疾病數(shù)據(jù)庫靶點信息進(jìn)行整理。

1.3 QYT對AP的共同靶點獲取 將QYT藥物靶點與疾病靶點于Venny在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)錄入取交叉，得到藥物與疾病發(fā)生作用的共同靶點。

1.4 “中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建 將QYT全部中藥活性成分靶點和AP疾病靶點蛋白導(dǎo)入至Cytoscape3.7.1軟件，生成“中藥-活性成分-靶點”的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 藥物-疾病靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選得到的“QYT-AP”活性化合物成分共同靶蛋白錄入STRING 11.0[6]（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，分析得到蛋白-蛋白互相作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.6 功能富集分析 將QYT治療AP的作用靶點，以Gene Symbol的格式導(dǎo)入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因本位論功能（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書通路富集分析（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）。設(shè)定閾值P＜0.05，篩選具有顯著性差異的生物學(xué)過程和通路。

1.7 動物實驗

1.7.1 藥物和儀器 雨蛙肽及脂多糖購自Sigma；中藥QYT[柴胡5 g，黃芩3 g，胡黃連3 g，白芍5 g，木香3 g，延胡索3 g，生大黃（后下）5 g，芒硝3 g]購自天津市南開醫(yī)院藥房，采取水煎法制備藥物：藥液比例為1:1的QYT濃縮液；α-淀粉酶（AMS）試劑盒（淀粉-碘比色法）購自南京建成生物工程研究所；LC3、P62、β-actin抗體均購自Abcam公司。石蠟組織塊包埋機(jī)、病理切片機(jī)、攤片機(jī)、烘片機(jī)、病理染色機(jī)、全自動玻璃蓋片機(jī)、顯微鏡均為美國Leica公司。

1.7.2 實驗動物準(zhǔn)備及分組24只體重為20～22 g雄性健康C57 BL/6小鼠（SPF級），購自北京華阜康生物科技股份有限公司[小鼠許可證號：SCXK（京）2014-0004]，飼養(yǎng)于天津市南開醫(yī)院試驗動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為正常對照組8只，AP模型組（AP組）8只，QYT+AP模型組（QYT組）8只。全部小鼠在自由飲水條件下禁食12 h后開始實驗。依據(jù)文獻(xiàn)[7]，采取雨蛙肽及脂多糖腹腔注射方法制備小鼠AP模型。對AP組、QYT組小鼠腹腔注射雨蛙肽（50 μg/kg），每小時1次，連續(xù)注射7次；在第7次注射的同時給予脂多糖（10 mg/kg）腹腔注射。QYT組在第1次雨蛙肽注射前1 h及第7次雨蛙素注射后1 h，予以QYT（10 mL/kg）灌胃。正常對照組小鼠予以同等次數(shù)、劑量的生理鹽水腹腔注射及灌胃。

1.7.3 標(biāo)本采集與檢測 末次注藥后12 h處死小鼠，收集小鼠血清樣本。使用血清淀粉酶試劑盒檢測血清淀粉酶含量，嚴(yán)格按照說明書操作進(jìn)行；切取胰腺組織標(biāo)本，一部分進(jìn)行固定、包埋、切片、HE染色，封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組胰腺組織結(jié)構(gòu)并依照Schmidt病理評分標(biāo)準(zhǔn)[8]對其嚴(yán)重程度進(jìn)行評分。

1.7.4 胰腺組織自噬情況檢測 取小鼠胰腺組織1 mm3于4℃條件下用2.5%戊二醛固定2 h，經(jīng)鋨酸固定、乙醇脫水、丙酮浸潤、3%醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色后切片等步驟，于透射電鏡下觀察胰腺組織并拍照。

1.7.5 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 另取部分小鼠胰腺組織，于含PMSF的RIPA裂解液中充分勻漿裂解，進(jìn)行BCA蛋白定量檢測蛋白濃度后，采用Western印跡法檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62蛋白表達(dá)情況，經(jīng)SDS-PAGE電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、封閉、發(fā)光成像等步驟，用Image J軟件分析灰度值以獲知蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism8.0.2軟件進(jìn)行處理，計量資料用±s表示，通過單因素方差分析比較各組間差異，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QYT化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫及化學(xué)成分作用靶點數(shù)據(jù)庫的篩選 通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索清胰湯全方8味中藥，以Inference Score＞20為篩選條件，柴胡共找到81種化合物，大黃58種，白芍35種，木香66種，黃芩63種，胡黃連23種，延胡索46種，芒硝（Na2SO4·10H2O)化合物信息未得到。刪除重復(fù)值后，得到QYT中含有的214個化合物，并收集活性化合物的對應(yīng)蛋白靶點，刪除重復(fù)值后總共獲取1 853個蛋白靶點。

2.2 AP疾病靶點數(shù)據(jù)庫 通過在Gene Cards、CTD數(shù)據(jù)庫中檢索AP，選取Inference Score＞20分的蛋白靶點，篩選得到疾病相關(guān)靶點為1 000個。

2.3 QYT-AP共同靶點的篩選 在Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺上輸入1 853個藥物靶點、1 000個疾病靶點，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點145個，見圖1。

圖1 QYT與AP靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of the target intersection of QYT and AP

2.4 QYT中藥物活性化學(xué)成分和靶點QYT中有214個化合物，其中作用于145個藥物-疾病共同靶點的化合物有121個，前30個化合物見表1。

表1 QYT化合物表Tab 1 Basic information of compounds from QYT

2.5 QYT干預(yù)AP的PPI網(wǎng)絡(luò)圖 將145個QYT干預(yù)AP的靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置可信度（interaction score）為0.7，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。根據(jù)拓?fù)渲笜?biāo)度值（degree）調(diào)節(jié)節(jié)點顏色深淺以突出核心靶點，Degree結(jié)果顯示白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL6）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3、腫瘤抑制蛋白53（tumor suppressor 53，TP53）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）等為QYT干預(yù)AP的核心靶點。

圖2 QYT治療AP的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 2 PPI network of QYT in treating AP

2.6 GO生物學(xué)功能分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對145個共同靶點進(jìn)行GO功能分析，根據(jù)FDR＜0.05進(jìn)行篩選，共得到富集信息1 310條，其中生物學(xué)過程（biological process，BP）1 190條，分子功能（molecular function,MF）62條，細(xì)胞組成（cellular compo nent，CC）58條；BP、MF和CC前10條富集信息見圖3。MF分析可看出靶點主要涉及載體活性，染色質(zhì)DNA結(jié)合，羰基還原酶等分子功能。CC分析得出靶點主要涉及線粒體、線粒體基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞成分。BP分析得出靶點主要涉及核因子（NF）-κB正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、MAPK激活、JAK-STAT級聯(lián)反應(yīng)等生物學(xué)過程。

圖3 QYT干預(yù)AP靶點GO功能富集Fig 3 GO function enrichment of QYT in treating AP

2.7 KEGG通路富集分析KEGG分析得到67條通路信息，依P值排序居前10位的結(jié)果見表2。

表2 KEGG富集分析潛在相關(guān)通路（前10位）Tab 2 KEGG pathway enrichment analysis for candidate related pathway targets(top10)

2.8 動物實驗部分

2.8.1 各組小鼠血清淀粉酶結(jié)果 與正常對照組相比，AP組小鼠血清淀粉酶顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），QYT組血清淀粉酶明顯低于AP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 各組小鼠血清淀粉酶含量比較（±s）Tab 3 Comparison of serum amylase levels between groups（±s）

表3 各組小鼠血清淀粉酶含量比較（±s）Tab 3 Comparison of serum amylase levels between groups（±s）

注：AP組：急性胰腺炎模型組；QYT組：QYT給藥+AP模型組；AMY：血清淀粉酶；與正常對照組比較，*P<0.05；與AP組比較，△P<0.05

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2.8.2 胰腺組織病理變化HE結(jié)果可見正常對照組胰腺結(jié)構(gòu)基本完整，組織被膜完整，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列緊密，無水腫和炎癥浸潤；AP組胰腺腺泡水腫，小葉結(jié)構(gòu)破壞，間隔增寬，胰腺組織不同程度水腫壞死，伴大量炎性細(xì)胞浸潤，胰腺導(dǎo)管內(nèi)可見出血；QYT組也可見胰腺組織損傷，但程度明顯較AP組降低，見圖4。

圖4 各組小鼠胰腺組織HE染色（100×）Fig 4 HE staining of pancreatic tissues of all groups(100×)

2.8.3 胰腺組織病理評分 與正常對照組相比，AP組胰腺組織病理評分均明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義，與AP組相比，QYT組各項病理評分均明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（表4）。

表4 各組小鼠胰腺病理評分（±s）Tab 4 Pancreatic pathology score of mice in all groups（±s）

表4 各組小鼠胰腺病理評分（±s）Tab 4 Pancreatic pathology score of mice in all groups（±s）

注：AP組：急性胰腺炎模型組；QYT組：清胰湯給藥+急性胰腺炎模型組；與正常對照組相比，*P<0.05;與AP組比較，△P<0.05

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2.8.4 小鼠胰腺組織電鏡結(jié)果 如圖5所示，電鏡下觀察到正常對照組的腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)規(guī)則，基底區(qū)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富；AP組中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞質(zhì)內(nèi)自噬空泡明顯增多，酶原顆粒增加，個別可見細(xì)胞核固縮，線粒體腫脹、嵴消失；QYT組的胰腺腺泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病理改變程度明顯輕于AP組，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，酶原顆粒較正常對照組增多。

圖5 各組小鼠胰腺組織超微結(jié)構(gòu)電鏡圖（25 000×）Fig 5 Electron microscopy images of pancreatic tissues in all groups(25 000×)

2.8.5 蛋白印跡實驗 與正常對照組相比，AP組小鼠胰腺組織的LC3Ⅱ/Ⅰ比值、P62表達(dá)水平均明顯升高（均P<0.001）；與AP組相比，QYT組中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、P62表達(dá)水平降低（均P<0.001），見圖6。

圖6 各組胰腺組織中自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)Fig 6 Expression of autophagy marker protein in pancreatic tissues in all groups

3 討論

自噬作為分解代謝的過程，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要方式之一，在胰腺炎中，自噬被激活但溶酶體降解這一過程被抑制，自噬體形成增加與溶酶體降解降低之間的不平衡導(dǎo)致自噬通量阻滯，會導(dǎo)致嚴(yán)重的腺泡細(xì)胞變性和胰蛋白酶原激活，導(dǎo)致AP的發(fā)生[9]?，F(xiàn)有研究證明，QYT可通過抗凋亡，減少壞死，減輕炎癥反應(yīng)等多途徑發(fā)揮治療AP的作用，其中包括通過改善腸屏障通透性緩解AP的炎癥反應(yīng)[10]，減少腸道內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收，緩解AP引起的腸道屏障損傷[11]，及通過減少Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的凋亡來減少重癥AP誘導(dǎo)的急性肺損傷等[12]。但對QYT治療AP作用機(jī)制的研究相對孤立，基于分子機(jī)制的研究較少，故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)方法，對于QYT治療AP的作用機(jī)制進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬是QYT干預(yù)AP的途徑之一。

通路富集分析結(jié)果顯示，QYT治療AP的信號通路共67條，其中涉及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、炎癥性腸?。↖BD）、細(xì)胞凋亡、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、Janus激酶/STAT、P53、腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、MAPK等通路。其中PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是自噬啟動和調(diào)節(jié)的主要途徑[13]。PI3K通過磷酸化Akt，影響下游從而調(diào)節(jié)自噬。有研究表明mTOR激活后發(fā)生自噬，溶酶體重整可關(guān)閉自噬小體的形成，導(dǎo)致溶酶體重新形成，進(jìn)入下一輪自噬[14]。AMPK通過磷酸化mTORC1等自噬相關(guān)蛋白來直接促進(jìn)自噬，或通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子下游的自噬相關(guān)基因的表達(dá)來間接促進(jìn)自噬，硫化氫通過AMPK/mTOR途徑過度激活自噬而加重AP[15]；自噬與p53之間存在重要關(guān)系，p53激活自噬，自噬也可以通過為DNA復(fù)制和修復(fù)提供底物來抑制p53激活[16]。在QYT與AP靶點作用的活性化學(xué)成分中，大黃中的大黃素（emodin），可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬[17]。大黃中的大黃酸（rhein）通過產(chǎn)生ROS經(jīng)Fas死亡途徑和線粒體途徑誘導(dǎo)caspase依賴性凋亡，減弱自噬[18]。STRING結(jié)果顯示，藥物-疾病靶點主要作用于TP53、STAT3、IL-6、AKT1等靶點，IL-6通過多種互補(bǔ)機(jī)制調(diào)控自噬，包括抑制mTORC1的靶標(biāo)和激活A(yù)kt，刺激LC3的轉(zhuǎn)化和自噬體的形成，增加自噬酶產(chǎn)生。有研究表明miR-148a通過下調(diào)IL-6/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制自噬而作用于AP[19]。STAT3可作為由IL-6激活的急性期基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，通過上調(diào)自噬的負(fù)調(diào)節(jié)劑或下調(diào)必需的自噬基因，導(dǎo)致自噬抑制[20]。

動物實驗結(jié)果證實，在雨蛙素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的AP小鼠模型中，經(jīng)QYT治療后AP小鼠的炎癥減輕，自噬反應(yīng)減弱。

綜上所述，QYT可能通過調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮治療AP的作用。但QYT干預(yù)自噬過程的具體通路仍不明確，需進(jìn)一步完善體內(nèi)外實驗，進(jìn)行通路和具體作用靶點的驗證，為臨床的合理應(yīng)用以及新治療方法提供思路依據(jù)。