基于網(wǎng)絡藥理學探討三七抗急性肺損傷相關分子機制

查玉杰，曹麗睿，何慶，2

（1.西南交通大學醫(yī)學院，成都 610031；2.西南交通大學附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，成都 610031）

急性肺損傷是由各種肺內(nèi)外致病因素導致的急性、彌漫性炎癥肺損傷，進而引起急性呼吸衰竭的臨床綜合征，以肺血管通透性增高、肺泡腔滲出富含蛋白質(zhì)的液體、肺水腫以及透明膜的形成為主要病理特征。急性肺損傷是常見的呼吸危重癥之一，在重癥監(jiān)護病房病死率高達40%～50%[1-2]。目前，急性肺損傷的治療尚無特效藥，常規(guī)治療方法和藥物主要包括原發(fā)病治療、機械通氣療法、舒血管藥（一氧化氮、前列腺素）、表面活性劑、抗氧化劑、糖皮質(zhì)激素和抗炎藥等[3]，但不能達到理想的治療效果，病死率依然很高。近年來，人們對中醫(yī)藥治療急性肺損傷進行了深入研究，顯示出中醫(yī)藥治療急性肺損傷的巨大優(yōu)勢[4]。

三七是五加科人參屬植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根，其主要化學成分為皂苷類，化學結(jié)構(gòu)復雜，同時含有黃酮類、甾醇類、糖、揮發(fā)油、聚炔醇類、氨基酸和有機酸等化學成分，藥用價值極高[5]。三七的藥理作用主要體現(xiàn)活血止血，熟三七還具有補血益氣以及抗疲勞、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[6]。有研究表明，三七總皂苷可以降低血漿中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，緩解中性粒細胞浸潤和肺水腫程度，清除體內(nèi)氧自由基，有效地保護急性肺損傷[7]。

網(wǎng)絡藥理學是一門運用網(wǎng)絡方法分析藥物與疾病和靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”協(xié)同作用關系的藥理學分支學科[8]。中藥具有多成分、多作用靶點和多作用途徑的特點，而網(wǎng)絡藥理學的整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點與中醫(yī)藥學的基本特點相吻合，其作為一門新興學科為研究傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理學之間的相互關系搭建了橋梁[9]。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，從三七的物質(zhì)基礎出發(fā)，著眼于整體角度分析三七抗急性肺損傷的分子機制，同時為后續(xù)研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 三七活性成分與相關靶點篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫[10]以“三七”為關鍵詞進行檢索，獲取三七的活性成分，再以藥物動力學參數(shù)（藥物口服生物利用度OB≥30%，藥物相似性DL≥0.18）為篩選條件，以篩選后的結(jié)果作為三七的主要活性成分。再根據(jù)已發(fā)表的文獻[11]補充三七總皂苷成分。在Pub Chem數(shù)據(jù)庫中檢索篩選出的各個成分的2D結(jié)構(gòu)，保存其sdf格式文件，然后將每個sdf格式文件分別上傳至Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[12]，獲得每個活性成分的預測靶點，并以Probability＞0作為納入標準。最后統(tǒng)一在Uni Prot蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫將各成分作用的蛋白質(zhì)靶點進行規(guī)范。

1.2 急性肺損傷相關靶點篩選 在Gene Cards數(shù)據(jù)庫以“Acute Lung Injury”為關鍵詞進行檢索，挖掘急性肺損傷相關的潛在靶點。在此數(shù)據(jù)庫中Score值越高則代表該靶點與疾病聯(lián)系密切，因此本次篩選設定大于20分的目標靶點作為急性肺損傷的潛在靶點。同樣的，再分別在OMIM數(shù)據(jù)庫和DisGe NET數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲取與急性肺損傷相關的靶點。最后，對3個數(shù)據(jù)庫獲得的靶點進行合并，刪除重復值后得到急性肺損傷的相關靶點。

1.3 三七成分-急性肺損傷靶點PPI網(wǎng)絡構(gòu)建 為明確三七與急性肺損傷之間的相互作用關系，通過Venny2.1.0繪制韋恩圖，獲得三七活性成分和急性肺損傷預測基因靶點的交集。將交集基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫[13]，限定物種為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設為大于highest confidence（0.900），隱藏游離的節(jié)點，獲得交集基因的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡，并保存tsv格式文件。將結(jié)果導入Cytoscape3.7.2，得到PPI網(wǎng)絡后再利用MCODE插件對PPI網(wǎng)絡進一步分析。

1.4 三七成分-急性肺損傷靶點功能與通路富集分析Metascape平臺[14-15]擁有全面的注釋功能并且每月更新基因注釋的數(shù)據(jù)資料。將交集基因?qū)朐撈脚_，物種和物種分析均選擇“H.sapiens（68）”，設置P＜0.01，分4次分別對其主要生物學過程和代謝通路進行富集分析，保存結(jié)果并采用圖像處理與分析在線平臺對結(jié)果進行可視化。另外，再針對P值從小到大進行排序，篩選出P值最小的前20條KEGG通路，并繪制氣泡圖。

1.5 三七成分-急性肺損傷靶點-通路網(wǎng)絡構(gòu)建 根據(jù)篩選出的20條通路，利用Cytoscape3.7.2構(gòu)建三七成分-急性肺損傷-通路網(wǎng)絡，并采用其內(nèi)置工具Network Analyzer分析網(wǎng)絡圖的網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，根據(jù)參數(shù)判斷三七抗急性肺損傷的主要活性成分和關鍵靶點。

2 結(jié)果

2.1 三七活性成分與相關靶點 在TCMSP數(shù)據(jù)庫進行初步篩選后共得到119種成分，以OB≥30%且DL≥0.18篩選后獲得8種活性成分，分別為十八碳二烯（mandenol）、食脂素（DFV）、鄰苯二甲酸二異辛酯（diop）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、人參皂苷Rh2（ginsenoside rh2）、人參皂苷f2（ginsenoside f2）、槲皮素（quercetin）。經(jīng)文獻查閱得到三七總皂苷的5種成分，分別為人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）、人參皂苷rd_qt（ginsenoside rd_qt）、三七皂苷1（notoginsenosider1）、人參皂苷Rb1（ginsenosiderb1）、人參皂苷Re（ginsenosideRe）。由于人參皂苷rd_qt、三七皂苷1、人參皂苷rb1在Pub Chem數(shù)據(jù)庫未檢索到2D結(jié)構(gòu)的sdf文件，因此將這3個成分排除，而在后面的交集基因中未出現(xiàn)鄰苯二甲酸二異辛酯的任何預測基因靶點，因此也將其排除。最終一共獲得9種主要活性成分（見表1）。這9種活性成分從Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲取預測基因靶點刪除重復值后共有260個。

表1 三七主要成分及靶點數(shù)目Tab 1 The main components of Panax notoginseng and the number of targets

2.2急性肺損傷相關靶點 從Gene Cards數(shù)據(jù)庫共獲得6 400個靶點，由于得到的靶點數(shù)目較多，因此以條件Score值大于20分篩選后獲得607個靶點；從OMIM數(shù)據(jù)庫共獲得275個靶點；從Dis Ge NET數(shù)據(jù)庫一共獲得93個靶點；合并3個數(shù)據(jù)庫靶點再刪除重復值后，最終得到917個基因靶點。

2.3 三七成分-急性肺損傷靶點PPI網(wǎng)絡 利用Venny2.1.0繪制三七活性成分基因靶點與疾病基因靶點交集的韋恩圖（見圖1），從圖中可以看到二者共有交集靶點68個（見表2）。將這68個基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫后得到其相互作用關系，將結(jié)果導入Cytoscape3.7.2后得到PPI網(wǎng)絡圖（見圖2），網(wǎng)絡圖一共包含57個節(jié)點，168條邊，圖中節(jié)點顏色和大小代表每個靶點的Degree值，顏色越深，節(jié)點越大代表其Degree值越大，意味著這個靶點可能與三七抗急性肺損傷作用的關系越密切。通過比較，筆者推測Degree值最大的前5個靶點，即PIK3CA、PIK3R1、SRC、STAT3和VEGFA可能與三七抗急性肺損傷作用具有較大的相關性。

圖2 三七成分-急性肺損傷靶點PPI網(wǎng)絡Fig 2 PPI network of Panax notoginseng component-acute lung injury targets

表2 三七成分-急性肺損傷靶點Tab 2 Panax Notoginseng components-acute lung injury targets

圖1 三七成分-急性肺損傷靶點Fig 1 Panax Notoginseng components-acute lung injury targets

此外，利用Cytoscape的插件MCODE對PPI網(wǎng)絡進行了進一步分析，得到了兩個PPI網(wǎng)絡的潛在子網(wǎng)絡（見圖3），Cluster1包括12個節(jié)點、32條邊，Cluster2包括8個節(jié)點、15條邊。這兩個子網(wǎng)絡中的20個基因（MET、PIK3R1、F2、PIK3CA、ESR1、VEGFA、MMP9、APP、NR3C1、KIT、AGTR1、SRC、KDR、AKT1、HSP90AA1、PTK2、EGFR、STAT3、FGF2、IL2）可能是三七抗急性肺損傷作用的關鍵靶點。

圖3 PPI網(wǎng)絡中的子網(wǎng)絡Fig 3 Sub-network in PPI network

2.4 靶點功能與通路富集分析結(jié)果 可視化基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析將基因的功能分為3個部分，分別是生物過程（biological process，BP）（圖4A）、細胞組分（cellular component，CC）（圖4B）以及分子功能（molecular function，MF）（圖4C）。經(jīng)過Metascape平臺分析后，選取了具有代表性的富集表達集群（每個集群選一個）的前20或16的功能繪制了條形圖。從圖4A中可以看到，三七抗急性肺損傷參與的生物過程主要有氧化應激反應（response to oxidative stress）、炎癥反應的調(diào)節(jié)（regulation of inflammatory response）、活性氧簇代謝過程（reactive oxygen species metabolic process）、對有毒物質(zhì)的反應（response to toxic substance）、細胞因子介導的信號通路（cytokine-mediated signaling pathway）以及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路（transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway）等。通過KEGG分析（圖4D），可以看到三七抗急性肺損傷可能參與的通路有腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、p53信號通路（p53 signaling pathway）、核因子（NF）-κB信號通路（NF-kappa B signaling pathway）等。

圖4 三七成分-急性肺損傷靶點富集分析Fig 4 Enrichment analysis of Panax notoginseng component-acute lung injury targets

另外，還選出了P值最小的前20條KEGG通路（表3），并繪制了氣泡圖（圖5），可以看到富集基因較多的通路有磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K-Akt）信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Ras信號通路（ras signaling pathway）、Rap1信號通路（rap1 signalin g pathway）以及血管內(nèi)皮生長因子信號通路（VEGF signaling pathway）等。

圖5 KEGG氣泡圖Fig 5 KEGG bubble diagram

表3 三七成分-急性肺損傷靶點通路富集結(jié)果Tab 3 Pathway enrichment results of Panax Notoginseng components-acute lung injury targets

2.5 三七成分-急性肺損傷靶點-通路網(wǎng)絡 根據(jù)上述20條通路繪制出了三七成分-急性肺損傷-通路網(wǎng)絡（圖6），圖中節(jié)點顏色的深淺，形狀的大小都代表其Degree值的大小。再運用Cytoscape3.7.2的工具Network Analyzer分析網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，其中以槲皮素的Degree值最大為38，Betweenness Centrality為0.37，Closeness Centrality為0.52，因此預測槲皮素為三七抗急性肺損傷的主要活性成分，其次為食脂素、十八碳二烯、人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg1。其中基因Degree值排名最高的前5個基因分別為PIK3CA、AKT1、PIK3R1、VEGFA、EGFR，因此預測PIK3CA是三七抗急性肺損傷的主要靶點，其余如IGF1R、FGF2、MET、STAT3、KDR等亦是相對比較重要的靶點。

圖6 三七成分-急性肺損傷-通路網(wǎng)絡Fig 6 Panax Notoginseng components-acute lung injury-pathway network

3 討論

在中醫(yī)學中未出現(xiàn)過“急性肺損傷”的病名，但在中醫(yī)古籍中對其臨床癥狀卻有論述，在《素問·咳論篇》中：“肺咳之狀，咳而喘息有音，甚則唾血”就是對其臨床癥狀的描述。根據(jù)其臨床癥狀，咳嗽、呼吸困難、喘息鼻張等，可歸為“喘脫”“結(jié)胸”“暴喘”等范疇[16]。中醫(yī)藥的治療策略有祛邪扶正、清熱解毒、活血化瘀、通里攻下、宣肺利水。多種中藥具有抗炎、抗氧化作用，因此中藥制劑和提取物對急性肺損傷的治療亦是一大突破點[3]，如姜黃素、丁香提取物丁香酚等都具有一定的抗炎抗氧化作用，都有對急性肺損傷實驗對象的肺功能的改善作用。

近年來，三七活性成分如槲皮素、三七總皂苷等對急性肺損傷的治療研究有很多，表明三七對急性肺損傷有一定的改善作用。本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法初步篩選出了三七抗急性肺損傷的活性成分有槲皮素、食脂素、十八碳二烯、人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg1等。研究表明，經(jīng)槲皮素預處理后，可以通過抑制Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（JAK2/STAT3）信號通路的激活而改善氣體交換功能，抑制炎性介質(zhì)的釋放，從而減輕內(nèi)毒素誘導的急性肺損傷癥狀[17]。還有研究顯示，槲皮素處理可以明顯減輕海水吸入誘導的急性肺損傷小鼠的肺間質(zhì)及肺泡腔出血、水腫，以及肺臟組織結(jié)構(gòu)改變，減輕海水吸入誘發(fā)的M1型巨噬細胞極化，下調(diào)M1型巨噬細胞介導的促炎性免疫并上調(diào)抑炎性因子的表達，提示槲皮素可通過抑制肺M1型巨噬細胞極化及其介導的促炎免疫，減輕海水吸入誘導的急性肺損傷[18]。HSICH等[19]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh2可以通過調(diào)節(jié)小鼠的Toll樣受體4（TLR4）/PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Raf-1/絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和Keap1/Nrf2/HO-1信號通路，減輕脂多糖誘導的急性肺損傷。人參皂苷Rg1單用和聯(lián)用抗生素亞胺培南均能夠抑制膿毒癥小鼠的急性肺損傷[20]，而且之前的一項研究表明，人參皂苷Rg1還可以通過改善炎癥反應，調(diào)節(jié)M2型巨噬細胞的浸潤和抑制肺細胞凋亡而對脂多糖誘導的急性肺損傷起到保護作用[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，三七抗急性肺損傷作用涉及的靶點主要集中在PIK3CA、AKT1、PIK3R1、VEGFA、EGFR等，涉及的主要通路有PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路等。PI3K-Akt信號通路是由酶聯(lián)受體介導的能夠調(diào)節(jié)細胞生命活動的信號通路，該通路參與多種生長因子、細胞因子、細胞外基質(zhì)等的信號轉(zhuǎn)導，同時還參與促進細胞增殖、抑制凋亡、調(diào)控組織炎癥、腫瘤生長侵襲等過程[22]。SUI等[23]研究表明，CFTR蛋白可以通過增強PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而起到對脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠的保護作用，并抑制細胞自噬。Visfatin可參與人體的炎癥和免疫反應，WU等[24]發(fā)現(xiàn)采用visfatin干預后，PI3K和p-Akt的表達上調(diào)，Akt的表達下調(diào)，PI3K/Akt信號通路被激活，因此認為visfatin可以通過調(diào)節(jié)自噬因子的表達來激活PI3K/Akt信號通路，從而降低急性肺損傷中的自噬水平。此外，還有研究表明對急性肺損傷的治療，mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路同樣起著重要作用[25]。

綜上，本研究結(jié)果表明，三七抗急性肺損傷作用可能是通過槲皮素、人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg1等活性成分發(fā)揮主要作用的，涉及的主要作用靶點有PIK3CA、AKT1、PIK3R1、VEGFA、EGFR等。推測三七可能是通過PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路等發(fā)揮對急性肺損傷的治療作用。根據(jù)分析結(jié)果，本研究從三七的物質(zhì)基礎出發(fā)，著眼于整體角度分析三七抗急性肺損傷的分子機制，為后續(xù)研究提供一定的理論基礎。但是，本研究主要是以生物信息學與海量數(shù)據(jù)計算的結(jié)果為基礎，要明確三七的主要調(diào)控靶點還需要后續(xù)在此基礎進一步篩選并進行動物或細胞實驗進行驗證。