促紅細胞生成素治療糖尿病視網膜病變的研究進展

劉丹丹，徐國彤，張敬法

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR，簡稱糖網病)是糖尿病在眼部的一種嚴重并發(fā)癥。在我國糖尿病人群中DR患病率為23%。隨著糖尿病患者病程的延長，DR患病率逐年提高，致盲率也逐年上升。因此，及早發(fā)現及控制糖尿病，及時診治DR，降低致盲率，減輕家庭及社會負擔，已成為亟待解決的問題之一[1]。隨著臨床和基礎研究的不斷深入，DR不再是傳統(tǒng)意義上單純的微血管并發(fā)癥，而是糖尿病繼發(fā)的全視網膜并發(fā)癥，累及視網膜內各類細胞，包括神經元(神經節(jié)細胞、無長突細胞、水平細胞、雙極細胞和光感受器細胞)、血管組成細胞(周細胞和血管內皮細胞)、膠質細胞(Müller細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞)以及視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞[2]。當前對DR發(fā)病機制的認識聚焦為微血管病變、神經元病變以及中低度的炎癥反應。本文旨在探討促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)對DR的保護作用及機制，以期為EPO干預治療早期DR及視網膜退行性疾病提供新的方向。

1促紅細胞生成素及其在眼內的作用

EPO是一種糖蛋白激素，在體內具有抑制骨髓中紅系祖細胞的凋亡并誘導其分化成熟為紅細胞。胎兒發(fā)育期間，EPO主要在肝臟產生，成人后腎臟間質成纖維細胞成為產生EPO的主要來源，通過自分泌或旁分泌的方式經血流到達骨髓，刺激造血干細胞向紅細胞分化。然而，成人循環(huán)中大約10% EPO來自腎臟以外的組織，如大腦、視網膜、脾臟、肺、胎盤、子宮和睪丸[3]。隨著EPO及其受體(EPOR)在視網膜中的發(fā)現及其在DR中作用研究的深入。EPO對維持視網膜正常生理功能及在病理狀態(tài)下均具有重要作用。

EPO在人出生前對視覺發(fā)育至關重要。早在2008年，美國猶他大學的Shrena Patel研究發(fā)現胎兒玻璃體及血清中EPO含量隨胎齡增加而增加，且玻璃體中EPO濃度顯著較血清高[4]。在成人視網膜中，EPO表達調控主要基于組織中氧飽和度的反饋機制，即通過低氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)來調控。在缺氧條件下，HIF-1α表達增加、蛋白穩(wěn)定性增強并與HIF-1β形成二聚體轉運至細胞核中，根據細胞類型，誘導下游多種基因的轉錄[如EPO、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)]，影響視網膜功能[5]。

近年來，EPO在DR中的作用也相繼被挖掘。研究表明，在患有慢性腎功能衰竭的非糖尿病患者中，EPO治療可顯著增加低血糖發(fā)生率，提示EPO可能對胰腺β細胞有直接作用[6]。加拿大多倫多大學Diana Choi團隊研究發(fā)現，重組人EPO(rhEPO)可通過結合胰腺β細胞內EPOR激活下游JAK2激酶信號通路，最終增加β細胞數量，降低血糖水平[7]。除EPO全身作用外，我們團隊在臨床個案研究中發(fā)現，玻璃體腔內注射EPO可提高難治性、彌漫性糖尿病黃斑水腫患者的視力，并顯著減輕黃斑水腫[8]，表明眼內注射EPO對視網膜具有保護作用,該保護機制可能是通過負反饋抑制HIF-1α/VEGF信號通路，從而降低VEGF的表達與分泌[9]。隨著EPO治療DR的研究進展，其抗凋亡、神經保護、神經營養(yǎng)、抗炎、抗氧化等作用被相繼報道。

2 EPO在DR中的抗凋亡作用

神經元凋亡是包括DR在內的多種神經系統(tǒng)疾病的“終末共同途徑”[10]。在DR早期，視網膜內神經元發(fā)生退行性病變，主要以神經元凋亡(neuronal apoptosis)和膠質反應(reactive gliosis)為主要特征。研究表明EPO治療可減少早期DR動物模型中視網膜神經元的凋亡。外源EPO可與視網膜神經元細胞上EPOR結合，并激活JAK2激酶及其下游多個信號轉導途徑，包括細胞外信號調節(jié)激酶1/2(ERK1/2)和PI3K/Akt等信號通路，抑制促凋亡基因(如Bax和Bak)的表達并促進抗凋亡基因(如Bcl-xL和Bcl-2)的表達，從而抑制內在死亡途徑實現抗神經元凋亡作用[11](圖1)。

圖1 DR中，EPO的神經保護、抗凋亡和神經營養(yǎng)作用 ↑表示促進；表示抑制。

HIF-1α是EPO蛋白表達的主要調控因子，低氧條件下HIF-1α的過表達抑制了p53的泛素化和降解，維持了p53的穩(wěn)定性，從而導致凋亡相關基因表達增加，誘導細胞凋亡[12-13]。在糖尿病大鼠模型中，玻璃體腔注射外源EPO通過負反饋抑制其上游轉錄因子HIF-1α的表達[9]，這可能是EPO抑制神經元凋亡的作用機制之一。

3 EPO在DR中的神經保護和神經營養(yǎng)作用

EPO在多種中樞神經系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經保護和神經營養(yǎng)作用[14-15]。我們課題組在過去幾年中率先開展了在鏈脲菌素誘導的1型糖尿病大鼠眼內注射EPO的療效觀察，研究發(fā)現：玻璃體腔內注射EPO能有效保護視網膜內多種類型細胞(如各類神經元、血管組成細胞、膠質細胞、RPE細胞等)防止糖尿病損傷，為EPO干預治療早期DR提供了理論依據。在神經營養(yǎng)和保護作用方面，外源性EPO可通過與糖尿病大鼠視網膜內Müller細胞胞膜上的EPOR結合激活胞內ERK和Akt信號通路，刺激腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和睫狀神經營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)表達，減輕Müller細胞的反應性神經膠質增生[16]。

谷氨酸是視網膜中主要的興奮性神經遞質，視網膜內谷氨酸水平大量升高導致神經元興奮性毒性增加，從而促使糖尿病狀態(tài)下神經元的死亡。EPO可通過調節(jié)谷氨酸代謝相關蛋白的表達發(fā)揮其神經保護作用，如上調糖尿病大鼠視網膜內谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)和谷氨酸-天冬氨酸轉運體(glutamate-aspartate transporter,GLAST)的表達，從而維持正常的谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)；EPO可下調谷氨酸受體，減輕神經元過度興奮和神經元毒性[17]。此外，視網膜內氧化應激增強和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase,PARP]的激活也與DR的進展有關，EPO可抑制視網膜內聚ADP-核糖聚合物[PAR,poly (ADP-ribose)]的形成并降低核凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor,AIF)水平，維持視網膜內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[18]。

4 EPO對血-視網膜屏障的保護作用

糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)以及增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)是導致DR患者視力損傷或致盲最常見的并發(fā)癥。目前隨著醫(yī)療水平的進步及早期篩查、防治力度的加大，PDR發(fā)病率不斷降低。當前，DME成為DR患者最主要的致盲原因。DME發(fā)病機制復雜，血-視網膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)的破壞是主要原因。在前期臨床研究中，玻璃體腔注射EPO對難治性、彌漫性DME患者治療有效，能顯著消退黃斑水腫并提升視力[8]，表明EPO具有保護和維持BRB的作用。

4.1EPO對血-視網膜內屏障的保護作用血-視網膜內屏障(inner BRB,iBRB)主要由視網膜血管內皮細胞、周細胞、膠質細胞等組成，內皮細胞間所形成的緊密連接是組成iBRB的分子基礎。在DR進展過程中，視網膜內微血管內皮細胞及周細胞發(fā)生丟失和凋亡、緊密連接蛋白表達減少或分布異常、星形膠質細胞退行性改變、Müller細胞增生、小膠質細胞活化及各種炎性因子表達增加[19]，導致iBRB破壞、滲漏增加。玻璃體腔注射EPO可防止糖尿病大鼠視網膜內微血管內皮細胞和周細胞凋亡、降低視網膜微血管通透性，維持iBRB完整性[20-21]。在作用機制上，EPO通過抑制VEGF/VEGFR2/Src通路減少內皮細胞間黏附連接分子VE-cadherin的磷酸化和內化，從而維持內皮細胞屏障功能[20]。我們近期的研究發(fā)現，EPO可通過調節(jié)Src/Akt/cofilin信號通路抑制糖尿病大鼠視網膜內小膠質細胞活化和吞噬作用進而保護視網膜微血管完整性[22]。此外，EPO的抗炎作用在糖尿病大鼠視網膜內及乙二醛處理的Müller細胞模型中也得到了驗證[23]。EPO亦可通過維持視網膜Müller細胞中鋅轉運體8(zinc transporter 8,ZnT8)水平調控細胞內鋅離子水平，從而維持細胞穩(wěn)態(tài)[24]。以上研究均提示EPO對iBRB具有保護作用，維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

4.2EPO對血-視網膜外屏障的保護作用血-視網膜外屏障(outer BRB,oBRB)主要由RPE細胞及細胞間緊密連接構成，是維持視網膜穩(wěn)態(tài)及視覺生理狀態(tài)的重要基礎。大量有關DR臨床和基礎研究都觀察到oBRB的破壞以及RPE功能失常，包括早期細胞凋亡、細胞間連接破壞、RPE細胞轉運能力下降、生長因子或炎性因子表達異常等[25]。

糖尿病大鼠玻璃體腔注射EPO可通過下調RPE-Bruch膜-脈絡膜毛細血管復合體(RPE-Bruch’s membrane choriocapillaris complex,RBCC)中HIF-1α和JNK信號通路，從而上調RPE細胞中緊密連接蛋白，如ZO-1和occludin的表達，維持oBRB完整性。體外乙二醛誘導的RPE細胞模型驗證了上述保護作用[26]。在高糖+IL-1β誘導的RPE細胞模型中，EPO可通過激活下游的JAK2和PI3K/Akt信號通路，增加RPE細胞內Ca2+內流和細胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達，抑制高糖和IL-1β對oBRB功能的破壞[27]。

以上研究均表明EPO通過多條信號通路和途徑發(fā)揮了對血-視網膜屏障的保護作用，從而維持視網膜內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)(圖2)。

圖2 DR中EPO通過多條信號通路和途徑發(fā)揮其對血-視網膜屏障的保護作用。

5 EPO對視網膜退行性病變及其他眼病的保護作用

EPO具有的抗凋亡特性及神經保護、神經營養(yǎng)作用使其成為治療視網膜退行性疾病(如早產兒視網膜病變、視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性、青光眼等)的理想藥物。PDR和早產兒視網膜病變具有相似病因病理特征和發(fā)病過程。在疾病的早期階段，視網膜內HIF-1α被抑制或降解，EPO表達降低，此時外源給予EPO可通過上述多條途徑發(fā)揮保護作用以維持BRB完整性和神經元的正常生理功能。然而，在增殖性視網膜病變晚期，視網膜的嚴重缺氧導致HIF-1α大量表達，從而觸發(fā)大量新生血管形成，此時，EPO治療具有促進病理性新生血管形成的作用[28]。因此，增殖性疾病早期給予EPO可能是預防及控制病變進展的有效治療方法，而疾病晚期則需要抑制EPO。

對于其他多種視網膜退行性疾病如視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性及青光眼等，由于EPO具有抗凋亡和神經營養(yǎng)等作用，眼內注射可以阻止這些退行性眼病共同的晚期階段(終末共同途徑)，即細胞死亡，也具有潛在的應用價值。

6討論與展望

糖尿病已經成為全球范圍內的公共性疾病，DR作為糖尿病眼部并發(fā)癥，對糖尿病患者的生活質量產生巨大影響，加重患者及其家庭的醫(yī)療負擔。DR進展累及視網膜內幾乎所有類型細胞，例如導致周細胞和內皮細胞凋亡、星形膠質細胞退化、Müller細胞與小膠質細胞活化、視網膜神經元凋亡、RPE變性等。本文主要就EPO治療DR可能的作用機制進行了綜述，探討了EPO的神經保護、神經營養(yǎng)、抗炎、抗凋亡及保護BRB功能的作用，使得EPO或EPOR激動劑成為未來治療DR的潛在藥物。但EPO具有的促紅細胞生成作用也使其在PDR中的應用受到較大爭議[29]。研究表明，EPO可通過與不同形式的受體結合發(fā)揮不同功能：如結合同源二聚體(EPOR/EPOR)發(fā)揮促紅細胞生成作用，而結合異源二聚體(EPOR/βCR)發(fā)揮非促紅細胞生成作用，即神經保護作用等[30]。因此，選擇性靶向異源二聚體的新藥物研發(fā)，如具有非促紅細胞生成作用的EPO衍生肽有望成為后續(xù)預防及治療DR強有力的潛在藥物。另外，EPO/EPOR軸在其他多種神經退行性疾病中也被廣泛研究，如阿爾茨海默癥、帕金森病、肌萎縮性側索硬化癥、脊髓損傷等，EPO具有的抗氧化應激、抗凋亡及抑制繼發(fā)性神經炎癥過程的作用使其在神經退行性疾病治療方面具有廣闊的前景。