多西環(huán)素對人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成的影響

賀夢璇，張俊芳，楊 鈴，秦 柏，顧宏衛(wèi)，管懷進，石海紅

0引言

翼狀胬肉是最常見的眼表疾病之一，臨床表現(xiàn)為新生組織不斷生長、增厚，呈三角形逐漸侵入角膜，不僅影響美觀，還可導(dǎo)致干眼、角膜散光[1]，如覆蓋瞳孔區(qū)則嚴(yán)重影響患者視力。翼狀胬肉具有許多腫瘤樣特性，如輕度發(fā)育不良、局部浸潤、高復(fù)發(fā)率、雜合性丟失、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及P53基因突變等[2]，故可認(rèn)為其是一種腫瘤樣病變。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)是腫瘤缺乏血液和氧氣供應(yīng)時，腫瘤細(xì)胞通過自身變形及細(xì)胞外基質(zhì)重塑進而形成的類似血管樣的通道，是一種不依賴血管內(nèi)皮細(xì)胞的微循環(huán)形式[3]。這一結(jié)構(gòu)在眼脈絡(luò)膜惡性黑色素瘤中首次被發(fā)現(xiàn)[4]，是一種新的血液供應(yīng)模式。研究發(fā)現(xiàn)，VM也存在于翼狀胬肉組織中，參與胬肉的營養(yǎng)供應(yīng)[5]。多西環(huán)素(doxycycline，DOX)作為基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的廣譜抑制劑，具有抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解及重塑的能力。本研究利用人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞(human pterygium fibroblasts，HPFs)構(gòu)建翼狀胬肉體外VM模型，探討DOX對翼狀胬肉VM形成的影響及其可能的分子機制，為翼狀胬肉的防治提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1樣本采集收集2019-09于南通大學(xué)附屬醫(yī)院眼科行翼狀胬肉切除術(shù)的患者8例，其中男4例，女4例，年齡63.00±2.07歲，均為翼狀胬肉初發(fā)性進展期，排除其他眼表疾病和全身疾病。收集手術(shù)切除的新鮮翼狀胬肉頭部上皮下組織。本研究通過南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑與儀器主要試劑：胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶-EDTA、DMEM/F12培養(yǎng)基、DMSO(美國，Gibco公司)，強力霉素(美國，Selleck公司)，CCK-8試劑盒(日本，Dojindo公司)，Matrigel膠(美國，BectonDickinson公司)，過碘酸-雪夫(periodic acid schiff，PAS)染色試劑盒(中國，索萊寶公司)，鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體、鼠抗人角蛋白(CK)單克隆抗體、鼠抗人血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗體(英國，Abcam公司)，兔抗人MMP-9多克隆抗體(美國，GeneTex公司)，抗鼠/兔通用型免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(中國，基因科技股份有限公司)，細(xì)胞蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、抗體稀釋液及增強化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測試劑盒(中國，索萊寶公司)。主要儀器：紫外分光光度計(NanoDrop 2000c；美國，Thermo公司)，DM3000光學(xué)顯微鏡及顯微攝像系統(tǒng)(德國，Leica公司)，高速冷凍離心機(德國，Eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1HPFs原代培養(yǎng)、鑒定及實驗分組將手術(shù)切除的新鮮翼狀胬肉頭部上皮下組織用含1%青霉素-鏈霉素的PBS緩沖液漂洗3次，剪碎，加入0.08%胰蛋白酶-EDTA，室溫消化8min，完全培養(yǎng)基終止消化，1500r/min離心5min棄上清，將組織小塊均勻接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶底朝上置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，24h后待組織小塊貼壁，加入適量完全培養(yǎng)基，緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)，每3d換液一次。采用鼠抗人Vimentin單克隆抗體、鼠抗人CK單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色進行細(xì)胞鑒定，具體實驗步驟根據(jù)試劑說明書操作。本研究取2～5代細(xì)胞用于實驗，分為對照組(正常培養(yǎng))、DOX終濃度分別為50、100、200mg/L的低、中、高實驗組進行下游實驗。

1.2.2CCK-8法檢測細(xì)胞活力將處于對數(shù)生長階段的HPFs消化后以0.6×104個/孔的數(shù)量均勻接種在96孔板內(nèi)，每孔終體積100μL，每組設(shè)置6個復(fù)孔，24h后進行細(xì)胞分組處理，同時設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白對照組。分組處理48h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育2h后，用酶標(biāo)儀于450nm處測定每個孔的吸光度(OD值)，計算平均值。

1.2.3劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力將處于對數(shù)生長階段的HPFs消化后以1×105個/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度接近100%時，用200μL無菌槍頭在每個孔垂直、力道均勻地劃過2～3道豎線，PBS洗去懸浮細(xì)胞，然后換用無血清培養(yǎng)基分組培養(yǎng)，并于劃痕后0、48h通過顯微鏡拍照觀察，計算細(xì)胞在各個時間點向劃痕處移動的相對距離。

1.2.4細(xì)胞三維培養(yǎng)及PAS染色將預(yù)先4℃過夜融化的Matrigel膠以每孔50μL加至96孔板，十字晃動，使之均勻分布避免產(chǎn)生氣泡。為防止Matrigel膠不均勻凝固，所有操作必須在冰上進行。將包被好的96孔板置于37℃孵箱內(nèi)30min使其固化。細(xì)胞分組處理48h后消化重懸，以0.8×104個/孔種于Matrigel膠上，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)排列及成管的完整程度，隨機選取5個不同視野計數(shù)成管的數(shù)量，取每個視野均值。觀察完成后，將上述培養(yǎng)5h后的細(xì)胞行PAS染色。染色步驟為0.5%高碘酸氧化5min，蒸餾水稍洗，Schiff氏液避光染色10min，0.5%偏重亞硫酸鈉分化2～5s，水洗2次，陽性表現(xiàn)為紫紅色。

1.2.5Westernblot檢測MMP-9和VEGF的表達收集分組處理48h后的細(xì)胞，利用細(xì)胞蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備10% SDS-PAGE凝膠，每孔加入20μg蛋白樣品，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，隨后分別加入兔抗人MMP-9抗體(1∶500)、鼠抗人VEGF抗體(1∶3000)、鼠抗人GAPDH抗體(1∶5000)4℃孵育，12h后，TBST漂洗，加入相應(yīng)二抗(1∶5000)室溫孵育1h，化學(xué)發(fā)光法顯影，成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析各組灰度值。

2結(jié)果

2.1HPFs原代培養(yǎng)及鑒定翼狀胬肉組織塊接種后約10d可見成纖維細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，細(xì)胞形態(tài)多為長梭形、三角形，逐漸向四周延伸，其間夾雜部分類圓形上皮細(xì)胞(圖1A)。當(dāng)細(xì)胞傳至第2代已基本純化，呈長梭形，細(xì)胞長滿后呈旋渦狀(圖1B)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示CK表達陰性(圖1C)，Vimentin表達陽性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色染色(圖1D)，符合成纖維細(xì)胞特性。

圖1 HPFs原代培養(yǎng)及鑒定 A：翼狀胬肉組織塊邊緣成纖維細(xì)胞(箭頭示)向四周生長；B：經(jīng)傳代純化后的HPFs呈旋渦狀生長；C：CK表達陰性；D：Vimentin表達陽性，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。

2.2DOX對HPFs活力的影響CCK-8實驗結(jié)果顯示，對照組、DOX低、中、高濃度組HPFs的OD值分別為1.14±0.09、0.91±0.09、0.71±0.05、0.23±0.02，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=447.888，P<0.05)，且DOX處理組之間兩兩相比，差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明DOX抑制HPFs活力呈劑量依賴性。

2.3DOX對HPFs遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，對照組、DOX低、中、高濃度組HPFs的遷移距離分別為0.21±0.01、0.15±0.00、0.04±0.01、-0.01±0.00mm，各濃度DOX組細(xì)胞遷移距離均明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=778.511，P<0.05)。三組DOX組組間相比，遷移距離差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。200mg/L DOX組因藥物濃度較高，細(xì)胞質(zhì)減少，細(xì)胞變小，故劃痕間距增加。結(jié)果表明，DOX具有抑制HPFs細(xì)胞遷移的作用，且呈劑量依賴性，見圖2。

圖2 DOX對HPFs遷移能力的影響。

2.4DOX對HPFs血管生成擬態(tài)的影響細(xì)胞三維培養(yǎng)結(jié)果顯示，HPFs能夠黏附于Matrigel膠表面，通過細(xì)胞自身變性、彼此相連形成大小不等的網(wǎng)格樣、環(huán)狀管腔結(jié)構(gòu)。對照組PAS染色呈陽性，提示管腔樣結(jié)構(gòu)是由HPFs構(gòu)成，即VM。可見對照組及DOX低濃度組形成的管腔均完整(圖3A、3B)，當(dāng)DOX濃度大于50mg/L時，開始出現(xiàn)不完整的管腔形態(tài)，部分細(xì)胞形成樹枝樣結(jié)構(gòu)(圖3C、3D)。對照組、DOX低、中、高濃度組形成的VM密度分別為每10倍視野37.33±2.08、28.33±1.53、12.00±1.00、1.67±0.58個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=384.889，P<0.05，圖3E)，且DOX處理組之間兩兩相比，差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，隨著DOX濃度的增加，VM逐漸變小，數(shù)量逐漸減少，直至不能形成完整的管腔結(jié)構(gòu)。

圖3 DOX對HPFs血管生成擬態(tài)的影響 A：對照組，形成網(wǎng)格樣、環(huán)狀管腔結(jié)構(gòu)，PAS染色呈陽性；B：DOX低濃度組，管腔結(jié)構(gòu)完整，周徑變小，數(shù)量減少；C：DOX中濃度組，部分細(xì)胞形成樹枝樣結(jié)構(gòu)，不能形成完整的管腔，管腔數(shù)較少；D：DOX高濃度組，無明顯管腔結(jié)構(gòu)形成；E：各組細(xì)胞VM密度的比較，aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 50mg/L DOX組；eP<0.05 vs 100mg/L DOX組。

2.5DOX對HPFs中MMP-9和VEGF表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、DOX低、中、高濃度組細(xì)胞MMP-9和VEGF蛋白相對表達量差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=94.239，P<0.05；F=396.281，P<0.05)。結(jié)果表明，隨著DOX濃度增高，MMP-9及VEGF蛋白表達下調(diào)，見圖4。

圖4 DOX對HPFs中MMP-9及VEGF表達的影響 A：Western blot檢測結(jié)果；B：MMP-9相對表達量化分析結(jié)果；C：VEGF相對表達量化分析結(jié)果。aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 50mg/L DOX組；eP<0.05 vs 100mg/L DOX組。

2.6HPFs血管生成擬態(tài)與MMP-9和VEGF表達的相關(guān)性雙變量相關(guān)性分析顯示，HPFs形成的VM密度與MMP-9和VEGF蛋白的表達水平呈顯著正相關(guān)(r=0.949、0.960，均P<0.05)。

3討論

翼狀胬肉是眼科的常見病和多發(fā)病，據(jù)最新統(tǒng)計，我國40歲及以上人群翼狀胬肉患病率為13.4%[6]，處于較高水平，且隨著年齡的增長而不斷升高，多見于戶外勞動者，以漁民、農(nóng)民發(fā)病最多，可能與粉塵、日光、煙霧等長期慢性刺激有關(guān)[7]，但具體病因和發(fā)病機制尚未完全清楚[8]。李永平等[5]利用CD34/PAS雙染首次在翼狀胬肉組織中發(fā)現(xiàn)VM結(jié)構(gòu)，主要表現(xiàn)為PAS陽性的細(xì)胞外基質(zhì)包繞在成纖維細(xì)胞伸出的突起表面形成管道狀結(jié)構(gòu)。隨后陳俊杰等[9]證明VM在進展期翼狀胬肉中的陽性率明顯高于靜止期。目前，關(guān)于翼狀胬肉VM調(diào)控的相關(guān)機制尚未見報道。

VM是近年發(fā)現(xiàn)的存在于腫瘤中的一種新的微循環(huán)形式，其與常規(guī)的血管結(jié)構(gòu)不同，主要特點包括VM管道由腫瘤細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成；管道內(nèi)壁沒有血管內(nèi)皮細(xì)胞；血液可在無內(nèi)皮管道中流動；VM周圍沒有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤及壞死[10]。研究表明，VM表達陽性的腫瘤存在更強的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥能力且預(yù)后更差[11]。腫瘤VM調(diào)控的機制較為復(fù)雜，有研究表明，MMPs幾乎能降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的各種蛋白成分，是腫瘤侵襲周圍組織并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中最為關(guān)鍵的因子，與VM現(xiàn)象呈顯著正相關(guān)[12-13]。Xu等[14]在脈絡(luò)膜黑色素瘤組織中發(fā)現(xiàn)，VM陽性組織VEGF表達明顯高于VM陰性組織，且VEGF可以提高人類脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞遷移、侵襲及VM形成能力，VM與VEGF表達亦呈顯著正相關(guān)。與腫瘤組織相同，翼狀胬肉組織中MMP-9和VEGF的表達也明顯增加[15-16]。MMP-9可以降解胬肉細(xì)胞外基質(zhì)Ⅳ型、Ⅴ型膠原、彈性蛋白及明膠，導(dǎo)致前彈力層溶解，使胬肉向角膜及深層浸潤[17]。VEGF主要通過增加血管通透性、促進細(xì)胞外基質(zhì)變性、提高血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及增殖能力等促進翼狀胬肉血管形成[18]。MMP-9和VEGF的高表達為翼狀胬肉形成VM提供了一定的分子基礎(chǔ)。

DOX不僅是一種長效的四環(huán)素類抗生素，而且還是MMPs的廣譜抑制劑，具有抗菌、抗炎、抑制細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)、抑制蛋白水解、減少血管生成等作用[19]，可有效抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、保護因腦梗而缺血的神經(jīng)[20]，參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[21]、牙周病[22]等多種疾病的治療。Meng等[23]研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射DOX(0.1mL/d)的肝癌裸鼠，腫瘤血管數(shù)及VM管腔數(shù)均較少，腫瘤生長緩慢，裸鼠存活時間延長；在體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞VM模型中，DOX可明顯減少VM的形成，降低MMPs的表達，推測DOX對肝癌VM的抑制作用可能與其降低MMPs的表達有關(guān)。Rúa等[24]在一項隨機雙盲安慰劑對照的臨床試驗中發(fā)現(xiàn)口服DOX(200mg/d)可降低部分患者翼狀胬肉體積，而具體的作用機制尚未行進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)DOX能顯著抑制HPFs的活力及遷移能力，降低HPFs的MMP-9及VEGF表達，在運用Matrigel膠構(gòu)建的三維培養(yǎng)HPFs模型中觀察到HPFs能在體外形成VM，這與李永平等[5]研究發(fā)現(xiàn)的翼狀胬肉VM結(jié)構(gòu)是由成纖維細(xì)胞構(gòu)成的結(jié)論一致。MMP-9及VEGF作為細(xì)胞遷移和侵襲的重要元素，本研究結(jié)果提示DOX可能通過下調(diào)MMP-9及VEGF的表達減慢HPFs分解細(xì)胞外基質(zhì)的速度，抑制細(xì)胞遷移的能力，進而減少HPFs構(gòu)建的VM數(shù)量。當(dāng)DOX濃度增加時，MMP-9和VEGF表達降低，VM的形成明顯受到抑制。相關(guān)性分析顯示，MMP-9和VEGF的表達與VM密度呈顯著正相關(guān)。大量研究表明，進展期翼狀胬肉組織中MMP-9和VEGF的表達明顯高于靜止期，復(fù)發(fā)型翼狀胬肉中這兩個分子的表達又明顯高于初發(fā)型，即MMP-9和VEGF的高表達與翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[25-28]。故我們推測VM也與翼狀胬肉的進展密切相關(guān)，VM陽性的翼狀胬肉組織具有更強的促進胬肉基質(zhì)蛋白降解、溶解角膜前彈力層及新生血管的能力，極大地促進翼狀胬肉的進展。這與VM陽性的腫瘤組織存在更強的侵襲及轉(zhuǎn)移能力一致。

綜上所述，DOX可通過減少MMP-9及VEGF的表達抑制HPFs的活力及遷移能力，減少VM的形成，提示MMP-9和VEGF可能參與翼狀胬肉表達VM的分子機制。但本研究仍存在不足，此次研究我們利用DOX作為降低MMP-9及VEGF表達的干預(yù)措施，僅在體外細(xì)胞水平上進行實驗，鑒于體內(nèi)外研究可能具有差異，將進一步進行活體實驗并進行毒理學(xué)方面的研究，為尋找新方法防治翼狀胬肉提供可靠依據(jù)。