醉蝶花莖葉粉碎物對葡萄灰霉病的抑制作用

趙星

摘? ? 要：灰霉病是葡萄的主要病害之一，目前噴施化學(xué)農(nóng)藥的防治方法雖然簡便快速，但會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，且容易在土壤中殘留，長期使用會使灰霉菌產(chǎn)生抗藥性。通過查閱大量資料及前期試驗發(fā)現(xiàn)，醉蝶花的存在可抑制多種土傳病害，本次試驗發(fā)現(xiàn)其對葡萄灰霉病也有較好的防治效果，并利用菌絲生長速率法確定了醉蝶花莖葉粉碎物抑制灰葡萄孢的最佳劑量，以此找到了環(huán)保有效、可替代化學(xué)藥劑的生物熏蒸劑，可在未來實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)并加以推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：葡萄灰霉病;醉蝶花;土傳病害;菌絲生長速率法;生物熏蒸劑

文章編號： 1005-2690（2021）14-0025-02? ? ? ?中國圖書分類號： S436.631.1? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

葡萄灰霉病（Grapegraymold）是由灰葡萄孢菌引起，在相對濕度75%～100%時可快速生長，在2～31 ℃下均能對葡萄新梢、葉片、果梗、花序和果實產(chǎn)生危害，是一種極具威脅性的真菌性病害[1]。該病為土傳病害，以菌絲體、菌核和分生孢子在病殘組織上越冬，是世界上對葡萄果實造成嚴(yán)重影響的病害之一。植株染病后，新梢和葉片會出現(xiàn)褐色病斑或灰色霉層，花序萎縮，幼果脫落，成果有凹陷病斑，前期在枝梗上出現(xiàn)淡褐色水浸狀病斑，中后期病部腐軟、病斑顏色加深。環(huán)境濕度大時，病斑上產(chǎn)生灰色霉?fàn)钗铮粗畡t使花序和幼果逐漸失水萎縮、干枯脫落。在葡萄開花期至幼果期發(fā)病，果實轉(zhuǎn)色期至成熟期危害最重，該時期主要為害葡萄果穗部分，使果穗軟腐，遇陰雨會長出一層灰白色霉層，造成果實腐爛脫落。該病每年有3次發(fā)病高峰期[2]，農(nóng)戶在種植時管理不細(xì)致、氮肥使用量大、氣候潮濕等情況都有利于葡萄灰霉病的發(fā)生，嚴(yán)重影響品質(zhì)和賣相，使農(nóng)戶損失慘重。

生物熏蒸技術(shù)是指通過分解植物代謝物產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體來達(dá)到抑菌效果。這種方法在中醫(yī)上較為常見，艾蒿“煙熏”、得克斯消毒劑“煙熏”都是利用類似原理達(dá)到除菌效果。但在目前的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，熏蒸技術(shù)的應(yīng)用較為空白。前期資料顯示該項技術(shù)除了能夠有效減少部分土傳病原菌的傳播、降低對作物的危害、提高作物產(chǎn)量，還可以減少土壤有機質(zhì)的流失、改善土壤的結(jié)構(gòu)，增加有益微生物的種群數(shù)量含量，保證現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。此技術(shù)源于利用含有硫代葡萄糖苷（Gl-

ucosinolates，GSLs）的植物抑制土傳病蟲害[3]，研究表明十字花科蔬菜液泡中含有黑芥子酶[4]，可分解GSLs產(chǎn)生大量的異硫酸氰酯類物質(zhì)[5]，具有廣泛的殺菌除螨、防蟲防病、分泌植保素等功效[6]。資料顯示，十字花科的多種植物中含有GSLs結(jié)構(gòu)，具有很大的生物防治潛能，醉蝶花就是其中一種[7-8]。

因此，應(yīng)進(jìn)一步研究其對灰霉的抑制作用并明確最佳用量，以求將其制成固定藥劑防止生長期及儲藏期的葡萄發(fā)生灰霉病，以此來幫助農(nóng)戶減少經(jīng)濟損失，同時此方法對于減少化學(xué)農(nóng)藥造成的土壤殘留問題及病原菌的抗性問題也具有重大意義[9]。

1? ?供試材料與方法

1.1? ?供試材料

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）屬于半知菌類（Fungi imperfecti）、絲孢綱（Hyphomycetes）、絲孢目（Moniliales）、淡色孢科（Moniliaceae）、葡萄孢屬（Botrytis）[10]，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室提供，經(jīng)過活化和形態(tài)學(xué)鑒定后用于本試驗。

醉蝶花莖葉粉碎物，保存于-80 ℃冰箱中，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)病理研究室提供。

1.2? ?PDA培養(yǎng)基的制作

制作1 L PDA培養(yǎng)基，需要稱取去皮馬鈴薯200 g，切成1 cm3的小正方體后放于鍋中，加入1 L蒸餾水，熬煮約10 min后?；疬^濾，定容到1 L后倒入鍋中繼續(xù)熬煮，同時緩慢加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，待其全部溶解后倒出、分裝滅菌。

1.3? ?灰霉菌的活化與形態(tài)學(xué)鑒定

將滅菌錐形瓶中的PDA加熱融化，稍冷卻后加入2～3滴青霉素以抑制細(xì)菌生長。在超凈工作臺中將其趁熱倒入5個滅菌的平板中備用。

取出實驗室冰箱中保存的灰霉菌進(jìn)行活化。在超凈臺中打開皿蓋，用直徑為0.90 cm的打孔器在菌落邊緣同一圈上打孔，用移菌勾挑取菌餅，倒置接種在已倒好的凝固的培養(yǎng)基上，貼上封口膜后倒置培養(yǎng)5 d。

選擇灰霉菌長勢較好且無雜菌生長的培養(yǎng)皿，挑取其中的菌落進(jìn)行形態(tài)鑒定。在載玻片上滴一滴水，用移菌勾挑取少量菌絲后在水中涂抹，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察。

視野中的菌分生孢子梗叢生，頂端膨大或是尖削，在其上有小的突起;分生孢子單生于小突起之上;分生孢子亞球形或卵形[11]。經(jīng)過鑒定該菌確為灰葡萄孢后將其保存好備用。

2? ?試驗方法

2.1? ?供試真菌接種

采用菌絲生長速率法測定醉蝶花對葡萄灰霉病菌絲的抑制效果。取出-80 ℃冷凍保存的醉蝶花粉碎葉片備用，將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的葡萄灰霉病病菌，用直徑為0.9 cm的打孔器在同一半徑的菌落邊緣打孔并挑取菌餅，用移菌鉤將菌餅接種于倒有PDA的9.0 cm培養(yǎng)皿中央備用[12]。

2.2? ?莖葉粉碎物對灰霉抑菌活性的測定

分別稱量醉蝶花莖葉粉碎物0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g各3份，分別快速倒入接好菌的培養(yǎng)皿皿蓋上，用封口膜封好后在20 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況，并記錄數(shù)據(jù)[13]。

2.3? ?結(jié)果調(diào)查與統(tǒng)計分析

每處理3次重復(fù)，對每個培養(yǎng)皿中的菌落用十字交叉法垂直測量直徑，取其平均值。根據(jù)測得的結(jié)果，計算醉蝶花提取液對葡萄灰霉病菌的菌絲生長抑制率。

3? ?結(jié)論與分析

3.1? ?試驗結(jié)論

本試驗首次發(fā)現(xiàn)了醉蝶花莖葉粉碎物對葡萄灰霉病病菌的抑制作用，并通過試驗確定了粉碎物發(fā)揮抑菌作用的最適劑量。結(jié)果表明，0.2 g/皿、0.4 g/皿 0.6 g/皿、0.8 g/皿、1.0 g/皿都有一定的抑菌效果，其中1.0 g/皿和0.8 g/皿的效果較好，0.8 g/皿左右的濃度抑菌效果最好。試驗培養(yǎng)情況及統(tǒng)計結(jié)果見圖1、表1。

3.2? ?討論

回顧整個試驗過程，本試驗設(shè)計存在以下一些問題，需要進(jìn)一步改進(jìn)。

（1）醉蝶花莖葉粉碎物這一材料是取自-80 ℃的冰箱中，取出時粉碎物上含有細(xì)小冰晶且無法分離，故稱量時的質(zhì)量包含一定冰的質(zhì)量，而不是粉碎物的凈重，造成所稱量的粉碎物偏少，小于應(yīng)該稱量的理論值。

（2）在稱量過程中，粉碎物表面的冰會融化成水，使粉碎物粘連在稱量紙上，導(dǎo)致向培養(yǎng)基中倒入粉碎物這一過程速度減緩，且無法一次性快速全部倒出。這就導(dǎo)致了兩個問題，一個是會損失一部分粉碎物，使實際上發(fā)揮熏蒸作用的量比所需的理論值小;另一方面就是打開皿蓋較長時間會導(dǎo)致雜菌進(jìn)入，造成污染。

另外，下一階段本試驗還需要從以下幾方面繼續(xù)深入探究。

（1）在試驗后期發(fā)現(xiàn)，醉蝶花莖葉粉碎物發(fā)黃變質(zhì)，這證明莖葉粉碎物常溫下無法保存太久，無法持續(xù)發(fā)揮藥效，因此需要提取有效物質(zhì)用于生產(chǎn)實踐，而不是直接使用莖葉粉碎物。

（2）雖然確定了醉蝶花本身具有抑菌作用，但究竟是哪些物質(zhì)起到了抑菌作用目前尚不明確。因此需要進(jìn)一步分析其有效成分，并探究各有效成分的最適濃度。希望在明確有效成分后直接人工合成該物質(zhì)，制成藥劑在實踐中防治葡萄灰霉病。

4? ?結(jié)束語

葡萄灰霉病作為影響葡萄產(chǎn)量和品相的重要病害，目前的防治方法除了化學(xué)藥劑防治外還有選用抗病品種、加強栽培管理措施、施用化學(xué)藥劑以及物理防治方法，但這些方法都有各自的缺點：選用抗病品種，不同的葡萄品種間對灰霉病的抗性差異顯著，病害可能發(fā)生突變，對原來具有抗性的植株不敏感，可以繼續(xù)危害，導(dǎo)致抗病品種的抗性消失;通過加強水肥管理在整枝定穗初期進(jìn)行防治，通過間種、套作、輪作等方式，減少病原寄主，效果良好，持續(xù)時間長，但工作繁重冗雜，處理起來較為困難;大棚等種植場所、修剪種植工具應(yīng)及時消毒，減少菌源，通過高溫悶棚為苗床消毒，但此方法只能作為輔助，并不能真的防治病害。

隨著人們環(huán)保意識的增強，社會對于更加綠色安全的生物防治關(guān)注度也越來越高。化學(xué)農(nóng)藥雖然見效快，但其造成的環(huán)境污染也日漸顯現(xiàn)。病原菌開始出現(xiàn)抗病性，這使得農(nóng)民們不得不加大劑量或者不斷更換藥劑，造成更進(jìn)一步的污染和抗性增加，甚至出現(xiàn)交互抗性。因此生物農(nóng)藥的發(fā)明推廣迫在眉睫，而熏蒸技術(shù)作為更加高效的防治方法，發(fā)展前景廣闊[14]。用醉蝶花揮發(fā)物質(zhì)防治土傳病害，這一研究領(lǐng)域目前仍為空白，在發(fā)現(xiàn)其抑菌效果后，會以此為切入點，深入研究其對其他土傳病害的防治作用[15]。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 李廷剛，陳廣霞，張倩倩，等.葡萄灰葡萄孢生長及產(chǎn)孢條件研究[J].中外葡萄與葡萄酒，2021（2）：6-11.

[ 2 ] 祝婉瑩，孫影.淺析葡萄灰霉病的發(fā)病規(guī)律及綠色防治措施[J].南方農(nóng)機，2020，51（9）：83.

[ 3 ] 張大琪，顏冬冬，方文生，等.生物熏蒸——環(huán)境友好型土壤熏蒸技術(shù)[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2020，22（1）：11-18.

[ 4 ] 宋曙輝，薛穎.幾種十字花科蔬菜抑菌作用的初步研究[J].蔬菜，1997（4）：24-25.

[ 5 ] 李玉群，范成明.生物熏蒸法控制蕓苔屬植物土傳病害[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2006（2）：57-60.

[ 6 ] Yedidia I，Benhamou N，Chet I. Induction of defense responses in cucumber plants（Cucumis sativus L.）by the biocontrol agent Trichoderma harzianum[J].Applied and Environmental Microbiology，1999，65（3）：1061-1070.

[ 7 ] 張迪，王曉東.葡萄灰霉病生物防治研究進(jìn)展[J].中國植保導(dǎo)刊，2017，37（7）：24-28.

[ 8 ] 曲田麗，羅小勇，金玉蘭，等.大花金雞菊花提取物對幾種植物病原真菌的抑制活性[J].中國植保導(dǎo)刊，2013，33（5）：57-58.

[ 9 ] Sudhakar， M.， Rao， C. V.， Rao， P. M.， et al， D. B.Evaluation of antimicrobial activity of Cleome viscosa and Gmelina asiatica[J].Fitoterap，2006（7）：47-49. doi： 10.1016/j.fitote.2005.8.003.

[ 10 ] 張中義.中國真菌志 （第二十六卷）[M].北京：科學(xué)出版社，2006：57-73.

[ 11 ] 黃靈旺，徐丹丹，習(xí)平根，等.黃腐酸在防治葡萄果實采后灰霉病中的應(yīng)用[J].腐植酸，2020（6）：70-72.

[ 12 ] 郭書普.新版果樹病蟲害防治彩色圖鑒[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2010：95-96.

[ 13 ] 方獻(xiàn)平，查倩，奚曉軍，等.葡萄灰霉病抗性快速鑒定技術(shù)與應(yīng)用[J].中外葡萄與葡萄酒，2019（2）：42-45.

[ 14 ] 王紅麗，善文輝，胡?，帲?生防菌混合接種對葡萄灰霉病菌的防治效果[J].中國生物防治學(xué)報，2020，36（2）：265-271.

[ 15 ] 魏新燕，黃媛媛，黃亞麗，等.甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21對葡萄灰霉病菌的拮抗作用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，51（5）：883-892.