申嗪霉素水溶性液劑的研究與開發(fā)

王錦鵬，余迪雅，王理想，李俊凱，b

（長(zhǎng)江大學(xué)，a.農(nóng)學(xué)院；b.農(nóng)藥研究所，湖北 荊州 434025）

申嗪霉素是由熒光假單胞菌株M18經(jīng)生物培養(yǎng)分泌的一種生物殺菌劑，化學(xué)名稱為吩嗪-1-羧酸（Phenazine-1-carboxylic acid，PCA），具有廣譜抑制植物病原菌并促進(jìn)植物生長(zhǎng)的雙重功能，是繼井岡霉素之后在中國(guó)登記并大面積推廣使用的新型微生物源殺菌劑，具有安全、環(huán)保、高效和廣譜等特點(diǎn)［1，2］。申嗪霉素能有效防治小麥的赤霉病、全蝕病，水稻的紋枯病、稻曲病、稻瘟病，黃瓜的霜霉病、灰霉病以及辣椒疫病和西瓜枯萎病。長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院新農(nóng)藥研究與開發(fā)實(shí)驗(yàn)室基于申嗪霉素的結(jié)構(gòu)改造進(jìn)行了系列研究［3-9］，以期提高其生物活性和內(nèi)吸傳導(dǎo)性，也取得了一定成效。申嗪霉素目前市場(chǎng)上主要是懸浮劑單一劑型，本試驗(yàn)以申嗪霉素原藥為主要試驗(yàn)材料，通過與不同的堿或鹽，配制出申嗪霉素水溶性液劑。對(duì)農(nóng)藥新劑型的開發(fā)、生物農(nóng)藥更廣泛的推廣應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

98%申嗪霉素原藥由上海交通大學(xué)提供，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室純化后得到，氨水、異丙胺、氫氧化鈉、氫氧化鉀、丙酮均為市售分析純商品，農(nóng)藥助劑、去離子水。

1.2 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、超聲波震蕩儀、萬分之一天平、SX-500型滅菌鍋（上海田源生物技術(shù)有限公司）、SW-CJ-1BU型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、高效液相色譜儀（K2025型，山東悟空儀器有限公司）。

1.3 申嗪霉素水溶性液劑的配制

準(zhǔn)確稱取2.55 g 98%申嗪霉素原粉4份，分別向其中滴加一定量的異丙胺、氨水、氫氧化鉀溶液和氫氧化鈉溶液，邊滴加邊在超聲波震蕩儀中震蕩至申嗪霉素完全溶解，加入4 mL助劑，用去離子水補(bǔ)充至50.00 mL。過濾，得透明澄清溶液，即為5%申嗪霉素可溶性液劑。

1.4 申嗪霉素水溶性液劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)

在進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)之前對(duì)4種水溶性液劑分別進(jìn)行有效成分（申嗪霉素）含量測(cè)定。測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［10］，色譜條件：C18反相色譜柱（4.6 mm×150.0 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇∶1%磷酸水=50∶50～75∶25（V/V），流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10μL；柱溫25℃，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。然后將4種水溶性液劑分別轉(zhuǎn)入安倍瓶中，酒精噴燈封口，熱儲(chǔ)藏試驗(yàn)在（54±1）℃的恒溫水浴中儲(chǔ)藏14 d，冷儲(chǔ)藏試驗(yàn)在（4±1）℃的冰箱中儲(chǔ)藏14 d，常溫儲(chǔ)藏在常溫下儲(chǔ)藏60 d。再按照前述方法利用高效液相色譜法測(cè)定有效成分含量。平行3次重復(fù)，計(jì)算降解率，判斷其穩(wěn)定性。

1.5 申嗪霉素水溶性液劑的室內(nèi)毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法［11］，測(cè)定4種申嗪霉素鹽水溶性液劑和申嗪霉素原藥對(duì)水稻紋枯病菌絲的室內(nèi)毒力，計(jì)算各水溶性液劑對(duì)水稻紋枯病菌的EC50。

1.6 申嗪霉素水溶性液劑的田間試驗(yàn)

根據(jù)室內(nèi)毒力測(cè)定和穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果綜合考查，將申嗪霉素異丙胺鹽水溶性液劑進(jìn)行田間防治水稻紋枯病的試驗(yàn)。選取的試驗(yàn)田為水稻田，地勢(shì)平坦，土壤屬壤土，土壤肥力中上等，有機(jī)質(zhì)含量在1.3%左右，pH為7.2～7.8，栽培條件均勻一致。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)藥劑設(shè)定有效成分含量為4.5、7.5、10.5 g/hm23個(gè)劑量（制劑用量分別為90、150、210 g/hm2），以1%申嗪霉素懸浮劑為對(duì)照藥劑，使用劑量為1 050 g/hm2，每個(gè)處理4次重復(fù)，每小區(qū)30 m2，處理間設(shè)置75 cm保護(hù)行，除試驗(yàn)藥劑外，再未施用其他任何影響試驗(yàn)結(jié)果的殺菌劑。在水稻紋枯病發(fā)生初期（8月24日）第一次施藥，7 d后第二次施藥，第二次藥后10 d調(diào)查病情指數(shù)。根據(jù)水稻葉鞘和葉片為害癥狀程度進(jìn)行分級(jí)，以株為單位，采用每小區(qū)對(duì)角線5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)調(diào)查相連5叢，共25叢，分級(jí)并記錄總株數(shù)、病株數(shù)和病級(jí)數(shù)［12］。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，全株無?。?級(jí)，第4張葉片及其以下的葉鞘、葉片發(fā)?。ㄒ詣θ~為第1張葉片）；3級(jí)，第3張葉片及其以下的葉鞘、葉片發(fā)?。?級(jí)，第2張葉片及其以下的葉鞘、葉片發(fā)?。?級(jí)，劍葉葉片及其以下的葉鞘、葉片發(fā)??；9級(jí)，全株發(fā)病，提早枯死。按下列公式計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 申嗪霉素水溶性液劑的穩(wěn)定性結(jié)果

經(jīng)過常溫儲(chǔ)藏、冷儲(chǔ)藏、熱儲(chǔ)藏，4種申嗪霉素水溶性液劑的降解率如表1所示。結(jié)果（表1）表明，在常溫儲(chǔ)藏條件下，申嗪霉素異丙胺鹽、銨鹽、鉀鹽和鈉鹽的水溶性液劑中申嗪霉素的降解率分別為0.82%、1.64%、1.41%和1.49%，申嗪霉素異丙胺鹽水溶性液劑的降解率最低，且在冷儲(chǔ)藏條件下的降解率低于熱儲(chǔ)藏條件下的降解率。

2.2 申嗪霉素水溶性液劑的室內(nèi)毒力測(cè)定

由表2可以看出，申嗪霉素異丙胺鹽水溶性液劑和申嗪霉素銨鹽水溶性液劑對(duì)水稻紋枯菌的殺菌活性優(yōu)于申嗪霉素鉀鹽水溶性液劑和申嗪霉素鈉鹽水溶性液劑，且申嗪霉素異丙胺鹽水溶性液劑防治水稻紋枯病效果與申嗪霉素差異不顯著。相較于其他3種申嗪霉素水溶性液劑，申嗪霉素異丙胺鹽水溶性液劑效果最優(yōu)，EC50為19.994 0μg/mL，申嗪霉素銨鹽水溶性液劑、申嗪霉素鉀鹽水溶性液劑、申嗪霉素鈉鹽水溶性液劑和申嗪霉素原藥的EC50分別為21.489 9、23.953 6、23.953 5、19.235 4μg/mL。

表2 申嗪霉素懸浮劑及申嗪霉素水溶性室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

表1經(jīng)冷儲(chǔ)、熱儲(chǔ)、常溫儲(chǔ)后申嗪霉素不同鹽的降解率

2.3 申嗪霉素水溶性液劑和1%申嗪霉素懸浮劑田間試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

田間試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，申嗪霉素異丙胺鹽水溶性液制劑用量為1 050 g/hm2時(shí)，對(duì)田間水稻紋枯病的防治效果最高，達(dá)84.35%，極顯著優(yōu)于1%申嗪霉素懸浮劑；申嗪霉素異丙胺鹽水溶性液劑用量為750 g/hm2時(shí)，對(duì)田間水稻紋枯病的防治效果為80.05%，與1%申嗪霉素懸浮劑防治效果相當(dāng)。

表3 申嗪霉素懸浮劑及申嗪霉素水溶性液劑田間試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，將申嗪霉素制成水溶性液劑后，具有較好的穩(wěn)定性。申嗪霉素異丙胺鹽水溶性液劑對(duì)水稻紋枯菌的殺菌活性優(yōu)于申嗪霉素鉀鹽水溶性液劑、申嗪霉素鈉鹽水溶性液劑和申嗪霉素銨鹽水溶性液劑。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，申嗪霉素異丙胺水溶性液劑高劑量時(shí)對(duì)田間水稻紋枯病的防治效果優(yōu)于1%申嗪霉素懸浮劑，達(dá)到了試驗(yàn)的預(yù)期效果，推薦田間用量為750～1 050 g/hm2。

農(nóng)藥劑型的研發(fā)主要方向?yàn)樗畡┬?、高含量、固體劑型和多功能制劑，本試驗(yàn)將申嗪霉素配制成5%水溶性液劑，其中，5%的申嗪霉素異丙胺鹽水溶性液劑與1%的申嗪霉素懸浮劑相比，室內(nèi)毒力與申嗪霉素相當(dāng)，田間藥效優(yōu)于1%申嗪霉素懸浮劑，而且具有更優(yōu)異的溶解性和分散性，便于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸，有利于藥效充分發(fā)揮。對(duì)于農(nóng)藥新劑型的開發(fā)、生物農(nóng)藥的推廣和保證農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全具有重要意義。