木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系篩選與鑒定

孫苗苗，李 娟，劉國慶，周春陽，韋張其，吳建鑫

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，合肥 230601；2.空軍第一后勤訓(xùn)練基地烹飪教研室，上海 200443）

隨著木質(zhì)纖維素生物降解機(jī)理研究的不斷深入，在生物降解過程中微生物間的協(xié)同關(guān)系也逐漸受到人們的重視，雖然纖維素的生物降解已研究了很長時(shí)間，但為了提高木質(zhì)纖維素的降解效率，不同領(lǐng)域的研究學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了大量的科研工作。近年來研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)纖維素降解需要經(jīng)過2種或更多種微生物的組合來完成，單一的微生物卻只能發(fā)揮微弱作用甚至沒有作用［1］。因此，人們越來越關(guān)注微生物混合培養(yǎng)或混合發(fā)酵，如Haruta等［2］富集篩選得到一組能夠有效降解稻草的復(fù)合菌系，該菌系在4 d時(shí)稻草降解率達(dá)60%。Wongwilaiwalin等［3］得到一組能夠有效降解工業(yè)蔗渣、稻草、工業(yè)桉樹紙漿的高溫纖維素降解復(fù)合菌群。目前國內(nèi)也有許多學(xué)者致力于木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系的研究，杜然等［4］構(gòu)建一個(gè)降解纖維素的兼性厭氧復(fù)合菌系培養(yǎng)72 h可使濾紙失重90%，且發(fā)酵3 d乙醇積累濃度可達(dá)1.54 g/L。劉爽［5］構(gòu)建的復(fù)合菌系在216 h內(nèi)稻草降解率達(dá)75%。崔宗均等［6］以4種高溫堆肥為原料構(gòu)建了一組高效穩(wěn)定的纖維素分解菌復(fù)合系MC1，該復(fù)合系8 d可將水稻秸稈完全降解。Wang等［7］通過限制性培養(yǎng)技術(shù)獲得了一組50℃靜置條件下培養(yǎng)的木質(zhì)纖維素快速降解復(fù)合菌系，培養(yǎng)3 d內(nèi)濾紙完全降解。利用類似的方法，Qin等［8］、Zhang等［9］、李維華等［10］也獲得具有木質(zhì)纖維素降解能力的復(fù)合菌系，均表現(xiàn)出較好的降解效果。因此，篩選能夠降解纖維素的高效復(fù)合菌，用于木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌株的使用已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［11，12］。

本研究以腐爛的秸稈為主要原料，利用纖維素剛果紅培養(yǎng)基分離純化菌系，通過羧甲基纖維素酶活性的測定、濾紙條的降解試驗(yàn)、菌株的復(fù)篩（濾紙條酶活、CMCase酶活測定）來選出高效微生物群系，構(gòu)建復(fù)合菌系，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選出高效微生物群系，之后進(jìn)行篩選檢測，確定微生物群系的組成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 宣城市宣州區(qū)合肥工業(yè)大學(xué)周邊田地腐爛的玉米秸稈。

1.1.2 試劑

1）DNS試劑。酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL去離子水中，加熱后，依次加入3，5-二硝基水楊酸0.63 g，NaOH 2.1 g，苯酚0.5 g，攪拌至完全溶解，冷卻后用去離子水定容至100 mL，于棕色瓶中7 d室溫保存。

2）pH 4.8檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L）。分別稱取10.51 g檸檬酸、14.71 g檸檬酸鈉，各自定容至500 mL，即為0.1 mol/L的檸檬酸和檸檬酸鈉溶液。取檸檬酸溶液和檸檬酸鈉溶液各11.5 mL，混勻后加入去離子水至50 mL，即為0.05 mol/L的pH 4.8檸檬酸緩沖溶液。

3）0.51%CMC-Na溶液。稱取0.51 g CMC，添加適量的0.05 mol/L檸檬酸緩沖溶液，加熱溶解定容至100 mL，用前充分搖勻。

4）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）。稱取1 g葡萄糖，加入去離子水定容至1 L，即為1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）纖維素剛果紅培養(yǎng)基。CMC-Na 2.0 g/L，（NH4）2SO42.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO41 g/L，Mg-SO4·7H2O 0.5 g/L，剛果紅0.4 g/L，瓊脂12 g/L，pH 7.0。

2）濾紙條崩解培養(yǎng)基［13］。（NH4）2SO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，酵母膏0.1 g/L，濾紙條（1 cm×6 cm）1條/試管，pH 7.0。

3）羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基。CMC-Na 10 g/L，蛋白胨2 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，酵母膏0.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

4）發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基［14］。玉米秸稈粉20 g，NH4NO34 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，無水CaCl20.4 g，NaCl 0.5 g，去離子水1 000 mL，pH 6.0。

5）CMC-Na固體培養(yǎng)基。CMC-Na 15 g，NH4NO31.0 g，酵母膏1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，去離子水1 000 mL，加入瓊脂20 g。

6）PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯浸汁（20%）100 mL，瓊脂2 g，葡萄糖2 g，pH 7.0。

7）高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基?？扇苄缘矸?.0 g，KNO30.1 g，K2HPO4·3H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，pH 7.2～7.4，瓊 脂1.5～2.0 g，去離子水100 mL。

1.1.4 主要儀器 DHG-9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；722型可見光分光光度計(jì)752N，上海儀電分析儀器有限公司；PHS-25型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；JW-3021H型高速離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；THZ-82A型數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器，常州市金壇科興儀器廠；BM1000型生物顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；YXQ-LS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FD-15-T-500A型中藥材高速粉碎機(jī)，上海市閔行區(qū)艦艇工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理與初篩

1）樣品處理。準(zhǔn)確稱取秸稈樣品10.0 g，加入到盛有90 mL無菌生理鹽水且?guī)в胁Ａе榈?50 mL三角瓶中，于37℃恒溫?fù)u床搖動(dòng)，將樣品充分混勻打散3 h備用。

2）初篩純化。首先，將采集的樣品用無菌水逐級(jí)稀釋至10-6、10-7和10-8倍后，分別取0.1 mL涂布于纖維素剛果紅選擇性培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度重復(fù)涂布3個(gè)平板，28℃培養(yǎng)，定期觀察，挑取菌落周圍出現(xiàn)清晰透明圈的菌株；然后，通過劃線分離純化所挑取的菌株，直至得到單菌落。

1.2.2 羧甲基纖維素酶活性的測定

1）將純化后的菌株進(jìn)行篩選，選擇生長狀況較為良好的菌株，初步根據(jù)顯微鏡下形態(tài)觀察確定菌株的種屬。

2）將霉菌和放線菌制成菌懸液分別涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和高氏1號(hào)培養(yǎng)基上，待霉菌菌落和放線菌菌落長出后，用打孔器取6 mm的菌餅，接種于纖維素剛果紅平板，而細(xì)菌則直接采取點(diǎn)接的方式接種于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察并測量透明圈的直徑；酶活高低的判斷則通過透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值進(jìn)行初步判斷。

重量控制系統(tǒng)基本原理是根據(jù)煙支實(shí)時(shí)重量，對平準(zhǔn)盤高度進(jìn)行調(diào)節(jié)來控制煙支重量，是一種典型的滯后控制系統(tǒng)。系統(tǒng)采用PID控制算法進(jìn)行控制。

1.2.3 濾紙條崩解試驗(yàn) 將篩選出的具有高CMCase活性的菌株進(jìn)行活化，分別取1 mL接種于裝有20 mL的濾紙條崩解培養(yǎng)基的試管中（每根試管放入2條濾紙條（每條6 cm），培養(yǎng)10～12 d，定期觀察濾紙條崩解情況［15］。

1.2.4 菌株的復(fù)篩

1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取8支潔凈的具塞試管進(jìn)行編號(hào)，并按照表1的要求依次加入溶液，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于20 mL試管中，用去離子水將每支試管補(bǔ)加至2.0 mL，將去離子水與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的混合溶液充分搖勻后，分別準(zhǔn)確加入DNS試劑2.0 mL，搖勻后沸水浴5 min，流水冷卻，用去離子水補(bǔ)足至20 mL。在540 nm處測定吸光度，以第1支試管進(jìn)行調(diào)零，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制

2）粗酶液的制備［16］。將通過挑選的菌株制成菌懸液，分別取2 mL菌懸液加入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)的150 mL三角瓶中。30℃、160 r/min，搖床培養(yǎng)3 d，獲得的培養(yǎng)液8 000 r/min離心15 min，所獲得的上清液即粗酶液。

3）酶活的測定［17］。①濾紙條酶活。取3根20 mL的具塞試管，分別向其中加入0.5 mL的粗酶液、1.5 mL的檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 4.8），向第1支試管中加入2.0 mL DNS試劑，搖勻并放入50℃水浴鍋中預(yù)熱5 min。各加入1條6 cm濾紙條，搖勻，50℃反應(yīng)60 min，取出后立即在第2、第3試管中加入2.0 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴5 min。取出冷卻至室溫，搖勻。以第1支試管為空白，在540 nm處測定吸光度。

②羧甲基纖維素酶活。取3根20 mL的具塞試管，分別向其中加入1.5 mL的0.51%CMC檸檬酸緩沖液，各加入0.5 mL酶液，向第1支試管中加入2.0 mL DNS試劑，搖勻并放入50℃水浴鍋中預(yù)熱。50℃反應(yīng)30 min。取出后除第1支試管外都加入2.0 mL的DNS試劑終止酶反應(yīng)。之后搖勻并沸水浴5 min，取出冷卻至室溫，搖勻。以第1支試管為空白，在540 nm處測定吸光度。酶活的單位與濾紙條酶活類似。

1.2.5 菌株的鑒定 將挑選出來的菌株首先采用形態(tài)觀察鑒定，之后根據(jù)它們的DNA序列和ITS序列比對進(jìn)行鑒定。

1）形態(tài)觀察。①采用劃線分離，挑取單菌落劃線于不同的培養(yǎng)基上，讓各菌株在適宜生長溫度下培養(yǎng)（細(xì)菌和放線菌28℃培養(yǎng)，真菌在30℃培養(yǎng)），觀察菌落的生長狀況，并做好記錄。②對生長良好的菌株進(jìn)行鏡檢觀察，觀察其在顯微鏡下的形態(tài)特征，并拍照記錄。

2）序列比對鑒定。首先采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌和放線菌總DNA，采用真菌基因組提取試劑盒提取真菌總DNA。

①細(xì)菌16SrDNA序列擴(kuò)增。采用338F（5′-AC TCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）與806R（5′-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物擴(kuò)增細(xì)菌菌株16S rDNA序列。PCR反應(yīng)體系：Phusion?Hot Start Flex 2X Master Mixart Version 12.5μL、Forward Primer 2.5μL、Reverse Primer 2.5μL、模板DNA 50μL、ddH2O 25μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；4℃保存。將擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行凝膠電泳檢測，觀察目的條帶是否存在并符合要求。

②真菌ITS2序列擴(kuò)增。采用fITS7（5′-GTG ARTCATCGAATCTTTG-3′）與ITS4（5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′）引物擴(kuò)增真菌菌株ITS序列。

PCR反應(yīng)體系：Phusion?Hot Start Flex 2X Master Mixart Version：12.5μL、Forward Primer 2.5μL、Reverse Primer 2.5μL、模板DNA 50μL、ddH2O 25μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；4℃保存。將擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行凝膠電泳檢測，觀察目的條帶是否存在并符合要求。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

2.1.1 分離純化結(jié)果 通過纖維素剛果紅培養(yǎng)基的涂布培養(yǎng)，選擇出24株生長較好的菌株對其編號(hào)，進(jìn)行分離純化并選擇出幾株菌株的生長情況，如圖1所示。從菌落形態(tài)可以初步判斷多數(shù)菌為霉菌、放線菌和少量的細(xì)菌。

圖1 部分單菌落生長情況

2.1.2 剛果紅初篩結(jié)果 將分離純化后生長迅速的菌株分別采取打孔、點(diǎn)接的方式進(jìn)行剛果紅培養(yǎng)篩選，觀察并測量其透明圈的直徑和菌落直徑。測量結(jié)果如表2所示，根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值大小，選擇出A1、A3、A4、N1、C1、G3、P1這7株菌株進(jìn)行濾紙條崩解試驗(yàn)。在這7株菌株中C1、N1這2株菌株的纖維素酶活較為明顯。

表2 菌落直徑與其對應(yīng)透明圈直徑大小匯總

由圖2可以看出，菌株羧甲基酶活的高低與菌株直徑、透明圈直徑的測量比值結(jié)果相一致。

圖2 剛果紅透明圈初篩結(jié)果

2.1.3 濾紙條崩解試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)濾紙條的降解情況判定符合條件的菌株。從圖3可以看出，多數(shù)濾紙條的降解程度不完全，處于濾紙條周邊出現(xiàn)毛邊的情況；部分是3/5發(fā)生降解；較少部分發(fā)生完全降解。發(fā)生降解的只是少部分，可能是只以濾紙條為碳源，其微生物需要的生長碳源供給不足。

圖3 濾紙條崩解試驗(yàn)結(jié)果

2.2 復(fù)篩結(jié)果

1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。所繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）的R2=0.999 3，說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合程度好，可以用于試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算。

圖4 DNS試劑測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2）濾紙酶活與CMCase酶活。根據(jù)濾紙酶活與CMCase酶活的測定方法，得到的菌株酶活如表3所示。從表3可以看出，A3、N1、C1這3株菌株的濾紙酶活較大，且其所對應(yīng)的CMCase酶活也相對較大?？赡苁且?yàn)楹Y選過程菌株沒有達(dá)到最優(yōu)的結(jié)果，以及在粗酶液制備過程的培養(yǎng)時(shí)間不夠。

表3 菌株酶活力 （單位：U/mL）

2.3 菌株鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)鑒定結(jié)果 將酶活較大的幾株菌株經(jīng)過CMC培養(yǎng)基劃線分離純化培養(yǎng)后得到不同的菌落，如圖5所示。根據(jù)菌落形態(tài)可以初步看出，部分菌落表面有菌絲，顏色呈現(xiàn)白色；有的菌落看起來為偏黃色，有酒香味；有的形成質(zhì)地致密的小菌落，干燥、不透明、難以挑取，菌落表面為粉末狀或顆粒狀。

圖5 單菌落形態(tài)鑒定

2.3.2 菌株鏡檢結(jié)果 顯微鏡觀察結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看到，鏡檢下的菌絲交織在一起，呈網(wǎng)狀，假性分支，樹枝狀，無規(guī)則發(fā)散蔓延生長，有明顯節(jié)狀。

圖6 菌株鏡檢結(jié)果

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

1）將擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行凝膠電泳檢測，得到的序列電泳如圖7所示，序列1、序列2、序列4為所挑選菌株目的條帶片段。由引物338 F和806 R PCR擴(kuò)增得到的目的片段長度約為469 bp，為了滿足建庫的需要，需對引物進(jìn)行修飾，合成帶有測序用接頭的引物，因此，實(shí)際電泳得到的片段長度更長。

圖7 細(xì)菌菌株16Sr DNA序列電泳結(jié)果

2）將擴(kuò)增后的ITS進(jìn)行凝膠電泳檢測，得到的序列電泳如圖8所示，序列1、序列3為所挑選菌株目的條帶片段。由PCR擴(kuò)增得到的目的片段長度約為353 bp，為了滿足建庫的需要，需用帶有測序用接頭的引物，因此，實(shí)際電泳得到的片段長度更長。

圖8 真菌ITS序列電泳結(jié)果

3）ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。利用MEGA軟件進(jìn)行ITS序列同源性比對，將菌株的ITS基因序列測得的DNA單鏈堿基序列提交NCBI中進(jìn)行在線BLAST同源比對后繪制菌種發(fā)育樹（圖9）。該菌株鑒定后結(jié)果顯示為栓菌（Trametes）、被孢霉（Mortierella）、稻瘟病菌（Sarocladium）、未分類的真菌（Fungiunclassified），其中，與稻瘟病菌的同源性較高，為83%。

圖9 ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

4）16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。利用MEGA軟件進(jìn)行ITS序列同源性比對，并采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將該菌株的16SrDNA基因序列與NCBI現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST序列比對，如圖10所示。該菌株鑒定后結(jié)果顯示為未分類的鏈霉菌（Streptomycetaceaeunclassified）、未分類的放線菌（Actinomycetalesunclassified）、丙酸桿菌（Propionibacterium）、鏈霉菌（Streptomyces）、未分類的細(xì)菌（Bacteriaunclassified）。其中，與鏈霉菌的同源性為87%。

圖10 16Sr DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

3 小結(jié)

本次試驗(yàn)僅研究了構(gòu)建高效復(fù)合菌的方法，并通過剛果紅纖維素培養(yǎng)基初篩、濾紙條降解試驗(yàn)、酶活測定復(fù)篩等構(gòu)建出一批相對高效的菌系，但是構(gòu)建復(fù)合菌的方法多樣以及不同木質(zhì)纖維素降解特性不同，還需要更加深入地研究和探討。