PRRSV誘導(dǎo)炎癥及氧化應(yīng)激的研究進(jìn)展

張文濤，郭艷余，黃金海，張 蕾

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）是引起豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）的病原體［1］。迄今為止，PRRSV主要分為2種基因型：PRRSV-1（歐洲基因型）和PRRSV-2（北美基因型）［2］，分別在1990年和1987年被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道［3］。在中國，自1995年P(guān)RRSV首次報(bào)道以來，PRRSV-2毒株已占主導(dǎo)地位［4，5］。由于2006年大規(guī)模PRRS暴發(fā)和高致病性PRRSV（HP-PRRSV）的鑒定，使得PRRSV毒株在中國流行，給國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［5，6］。2013年以后，PRRSV變異株NADC30－like又給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的打擊［7，8］。PRRSV的傳播途徑主要有以下3種：接觸性傳播（未感染豬接觸含病毒的口鼻分泌物、排泄物等）、精液傳播和空氣傳播［9］，其傳染力和引發(fā)的臨床癥狀與病毒的致病性、豬的易感性和表型、微生物的感染壓力和飼養(yǎng)環(huán)境有很大關(guān)系［10］。PRRSV毒株的基因型重組、變異及混合感染等特性也為其預(yù)防和控制帶來了巨大的困難。

PRRSV感染仔豬可以引起嚴(yán)重的系統(tǒng)性炎癥、間質(zhì)性肺炎和發(fā)熱等癥狀［11］，而其肺臟組織病理學(xué)觀察可見肺泡壁增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤間質(zhì)及肺泡中等間質(zhì)性肺炎的典型特征［12］，說明炎癥反應(yīng)在PRRSV感染和致病機(jī)制等方面扮演著重要的角色?；钚匝踝杂苫≧eactive oxygen species，ROS）的增加是引起氧化應(yīng)激的主要原因，也是發(fā)炎組織中致病性氧化損傷的標(biāo)志［13］。有報(bào)道指出，氧化應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子的過量會導(dǎo)致PRRSV等多種疾病的組織損傷［14］。這表明炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)在PRRSV感染和致病機(jī)制等方面起重要作用。因此，研究其致病機(jī)制對預(yù)防和控制PRRSV給養(yǎng)豬業(yè)帶來的損害至關(guān)重要，本研究就PRRSV引起炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為這方面研究提供參考。

1 PRRSV的基因組結(jié)構(gòu)特征

PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒，屬于動脈炎病毒科（Arteriviridae）動脈炎病毒屬（Genusarterivirus）［15］。其基因組長度約15 kb，含有11個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），分別是ORF1a、

ORF1a′、ORF1b、ORF2、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7，其中ORF1a、ORF1a′和ORF1b編碼4種已知的復(fù)制酶多聚蛋白（pp1a、pp1a-nsp2N、pp1a-nsp2TF和pp1ab），這些多聚蛋白會被4種病毒編碼的蛋白酶PLP1α、PLP1β、PLP2和SP共翻譯和翻譯后加工成至少16個(gè)不同的非結(jié)構(gòu)蛋白（Non-structural proteins，Nsps）。其結(jié)構(gòu)蛋白（Structural proteins）則僅通過一組亞基因組RNA（Subgenomic RNA，sgRNA）2-7通過共端不連續(xù)轉(zhuǎn)錄策略來翻譯，共含8個(gè)開放閱讀框，分別編碼糖蛋白2（Glycoprotein 2，GP2）、未糖基化包膜蛋白（E）、GP3、GP4、GP5、ORF5a蛋白、膜蛋白M和核衣殼蛋白（N）［15］。

2 PRRSV誘導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對微生物感染、外界刺激以及自身組織損傷作出的復(fù)雜生物學(xué)反應(yīng)，包括發(fā)紅、腫脹、發(fā)熱、疼痛以及組織功能受損等一系列癥狀。炎癥反應(yīng)既能保護(hù)機(jī)體，也能對機(jī)體造成持續(xù)性的傷害。這是因?yàn)橐环矫?，炎癥反應(yīng)能夠及時(shí)清理病原體和受損的細(xì)胞并引發(fā)愈合過程；另一方面，不受控制的炎癥反應(yīng)會引起組織和細(xì)胞的各種病變，誘發(fā)自身免疫性疾病及其他炎癥性疾病，甚至導(dǎo)致機(jī)體死亡。

在炎癥反應(yīng)過程中，由不同細(xì)胞群體（主要是免疫細(xì)胞）分泌的炎性細(xì)胞因子，因其生物學(xué)功能不同，主要分為兩類：促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子，其本質(zhì)是由免疫細(xì)胞分泌的信號蛋白，可以作用于分泌它們的相同細(xì)胞（自分泌信號）、鄰近細(xì)胞（旁分泌信號）或遙遠(yuǎn)的靶細(xì)胞（內(nèi)分泌信號）［16］，促進(jìn)細(xì)胞之間的相互作用和通信［17］。促炎細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素IL-1、IL-2、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子TNF-α等刺激炎癥發(fā)生，而抗炎細(xì)胞因子，例如IL-4、IL-10、IL-13和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）等抑制炎癥反應(yīng)［18］。通常情況下，促炎介質(zhì)編碼基因在健康機(jī)體不表達(dá)，但是如果由外傷、感染或毒素引起的炎癥，會觸發(fā)促炎介質(zhì)編碼基因的表達(dá)［18-21］。病毒感染早期屬于急性感染期，機(jī)體受到病原刺激后會立即誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等的表達(dá)以啟動炎癥反應(yīng)［22］。

2.1 PRRSV通過多條信號通路誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)

在很多呼吸道病毒感染中，促炎性細(xì)胞因子對于介導(dǎo)炎癥反應(yīng)激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答必不可少，而PRRSV感染會引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，誘導(dǎo)大量促炎性細(xì)胞因子的釋放，這是導(dǎo)致PRRSV感染豬后產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)的原因之一，也被認(rèn)為是PRRSV發(fā)病機(jī)理的原因之一［23，24］。PRRSV通過在鼻甲、扁桃體、肺、淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、腎臟、胸腺、腦、心臟、骨髓和脈絡(luò)叢等器官組織中復(fù)制，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等的大量產(chǎn)生，引起呼吸道感染和肺炎等疾?。?5-27］。這些促炎性細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)多條信號通路中起重要作用，表明PRRSV感染可能通過多種不同的信號通路誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

1）通過Toll樣受體信號通路誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Jing等［28］研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染原代豬肺泡巨噬細(xì)胞（Porcine Alveolar Macrophages，PAMs）后，IL-1β的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均以時(shí)間和劑量依賴性方式顯著增加，其中，TLR4-MyD88途徑和其下游信號傳導(dǎo)分子MAPK家族的ERK1/2和p38以及更下游的NF-κB都參與介導(dǎo)了PRRSV感染期間NLRP3的表達(dá)和IL-1β的產(chǎn)生（表1），同時(shí)宋爽［29］的研究也表明，PRRSV在感染PAM和非洲綠猴腎傳代細(xì)胞系Marc-145后，可以通過該信號通路誘導(dǎo)了IL-1β、IL-6和IL-8的產(chǎn)生［29］。Chen等［30］也發(fā)現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞中，MyD88-ERK1/2-AP-1信號通路在PRRSV誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生中起重要作用。Li等［31］的研究顯示，PRRSV通過TRIF-PKCβ1-TAK1-NF-κB信號通路上調(diào)多效炎癥細(xì)胞因子IL-15的表達(dá)。

表1 細(xì)胞信號通路縮略詞

2）通過RIG-I樣受體信號通路誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Yu等［32］研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV通過JNKAP-1和NF-κB信號通路誘導(dǎo)IL-12 p40（IL-12的基本亞基）的表達(dá)。還有研究人員發(fā)現(xiàn)，PRRSV可以通過JNK/AP-1途徑上調(diào)IL-8的表達(dá)，從而吸引中性粒細(xì)胞進(jìn)入肺，產(chǎn)生炎癥［33，34］。Li等［31］的研究顯示，PRRSV通過MAVS-PKCβ1-TAK1-NF-κB信號通路上調(diào)多效炎癥細(xì)胞因子IL-15的表達(dá)。

2.2 PRRSV多個(gè)蛋白誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，不同致病性的毒株引起的炎性細(xì)胞因子的分泌狀況也是不盡相同的［35］，并且不同病毒蛋白在誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)方面也發(fā)揮著不同的作用。

1）通過非結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。Fang等［36］的研究顯示，PRRSV（WUH3株）的Nsp2可誘導(dǎo)IκBα降解和NF-κB的核易位并誘導(dǎo)NF-κB依賴性炎性細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8等，也可能參與病毒對宿主細(xì)胞TNF-α反應(yīng)的調(diào)節(jié)［37］，同時(shí)寧娟［38］的研究也證明了Nsp2在Marc-145細(xì)胞中的表達(dá)能激活I(lǐng)L-8，但具體的結(jié)構(gòu)域未確定。Ying等［24］發(fā)現(xiàn)，PRRSV強(qiáng)毒株VR-2385的Nsp12能夠通過p38/MAPK途徑誘導(dǎo)STAT1的727位絲氨酸磷酸化水平升高以及IL-1β和IL-8的表達(dá)。PRRSV感染還會導(dǎo)致IL-10劑量依賴性表達(dá)，其表達(dá)與NF-kB信號通路和p38/MAPK通路相關(guān)［39，40］，PRRSV感染豬后會導(dǎo)致抗炎性細(xì)胞因子IL-10升高，并通過炎性細(xì)胞浸潤誘導(dǎo)肺部病變［41，42］，而PPRSV的Nsp11和Nsp5是IL-10的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)較強(qiáng)的IL-10反應(yīng)［43，44］。

2）通過結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。寧娟［38］的研究顯示，PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白的30～73氨基酸區(qū)域?qū)arc-145細(xì)胞中IL-8的激活和表達(dá)有作用。PRRSV感染還會導(dǎo)致IL-10劑量依賴性表達(dá)，其表達(dá)與NF-kB信號通路和p38/MAPK通路相關(guān)［39，40］，其結(jié)構(gòu)蛋白N和GP5可顯著激活I(lǐng)L-10的啟動［43］。綜上所述，PRRSV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的機(jī)制如圖1所示。

圖1 PRRSV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的機(jī)制

3 PRRSV誘導(dǎo)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受外來有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如ROS和活性氮自由基（Reactive nitrogen species，RNS）產(chǎn)生過多，而細(xì)胞無法清除過載的氧化物，致使中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，氧化中間產(chǎn)物增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞組織形成損傷［45］。氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)向調(diào)節(jié)作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素［45，46］。病毒感染會引起細(xì)胞ROS的釋放，過量的ROS會使生物膜磷脂層發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生丙二醛（Malondialdehyde，MDA）等代謝產(chǎn)物，激發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，因此，ROS可以調(diào)節(jié)宿主的炎癥和免疫反應(yīng)，也被認(rèn)為是病毒感染過程中引起細(xì)胞氧化應(yīng)激和氧化損傷的主要原因［47］。但是ROS在病毒性疾病病理進(jìn)程中也能激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，在病毒清除和免疫導(dǎo)致的細(xì)胞損傷方面起到正面的調(diào)節(jié)作用［48］。

1）PRRSV通過調(diào)控ROS相關(guān)通路導(dǎo)致氧化應(yīng)激。病毒感染期間氧化還原平衡的變化與病毒的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［49］，PRRSV作為一種RNA病毒，也可導(dǎo)致豬產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)［50，51］，并且張浩等［52］的研究表明，在高致病性PRRSV感染Marc-145細(xì)胞過程中，會使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且是通過ROS的產(chǎn)生來誘導(dǎo)氧化應(yīng)激［53，54］，而ROS的上調(diào)與線粒體功能障礙有關(guān)［54］，也可能歸因于細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）升高，而iNOS的升高與較高的熱休克蛋白90（HSP90）表達(dá)和較低的微囊蛋白1（Cav-1）表達(dá)有關(guān)［55］。線粒體ROS的產(chǎn)生還和PRRSV誘導(dǎo)的Marc-145細(xì)胞凋亡性死亡有關(guān)［13］，宿主細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)在PRRSV感染的發(fā)病機(jī)理中起重要作用［56］。而與PAM相比，PRRSV感染的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞（Monocytederived macrophages，MDMs）中產(chǎn)生了更高水平的ROS和促凋亡基因的表達(dá)［57］。ROS還可以攻擊生物膜上的多種不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化作用，從而誘導(dǎo)諸如NF-κB活化等細(xì)胞作用［58，59］。同時(shí)Yan等［51］的研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染Marc-145細(xì)胞之后會產(chǎn)生ROS并直接激活NF-κB，或通過激活某種細(xì)胞信號途徑產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致IkBα的降解以及隨后NF-κB的激活。

2）PRRSV通過抑制抗氧化酶活性導(dǎo)致氧化應(yīng)激。ROS調(diào)節(jié)細(xì)胞對病毒復(fù)制的允許性［60］，在PRRSV感染的豬中觀察到了谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）的降低［61］，這表明PRRSV感染后會通過抑制抗氧化酶活性導(dǎo)致氧化應(yīng)激。有研究表明，PRRSV可以下調(diào)Marc-145細(xì)胞、PAM細(xì)胞和受感染豬的肺組織中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）的表達(dá)，降低谷胱甘肽的表達(dá)，并增加ROS和MDA的產(chǎn)生［62］。這些結(jié)果表明，PRRSV誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激環(huán)境可能對于其病毒復(fù)制是有益的。而細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典的抗氧化途徑，NRF2-ARE信號通路可以通過促進(jìn)NADPH脫氫酶醌-1（NADPH Dehydrogenase Quinone-1，NQO1）和SOD等抗氧化酶的分泌，維持適當(dāng)?shù)难趸€原狀態(tài)，也會從另一方面抑制PRRSV感染引起的組織損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞和機(jī)體穩(wěn)態(tài)［62］。在感染了PRRSV的PAM細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中也檢測到了ROS的上調(diào)，他們的產(chǎn)生還增加了這些細(xì)胞在細(xì)胞因子水平上的炎癥反應(yīng)［63］，氧化應(yīng)激是病毒感染過程中非常重要的一環(huán)，病毒感染過程中也會通過炎癥性細(xì)胞因子（如TNF-α或IL-1）促進(jìn)ROS產(chǎn)生，之后ROS激活NF-κB進(jìn)而誘導(dǎo)SOD的過度表達(dá)，來降低線粒體中的氧化還原狀態(tài)的平衡［64］。這說明PRRSV誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)之間存在復(fù)雜的關(guān)系，值得深入研究。

4 展望

盡管在過去的30年中，研究人員對PRRSV引起的炎癥發(fā)病機(jī)理的分子機(jī)制取得了一些進(jìn)展，但是針對其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制卻研究較少。病毒感染后產(chǎn)生的ROS可在機(jī)體內(nèi)引起氧化應(yīng)激并引起巨噬細(xì)胞對炎性細(xì)胞因子（如TNF-α和IL-1等）的釋放，從而造成廣泛的損傷作用，加重疾病進(jìn)程［65］，而ROS清除劑可顯著消除促炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8）的活化，這表明ROS對于促炎性基因的產(chǎn)生也至關(guān)重要［63］。宋爽［29］的研究也發(fā)現(xiàn)，ROS也參與PRRSV感染誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6和IL-8的產(chǎn)生。而感染豬肺部的旁觀者效應(yīng)是由于病毒引起的促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的異常和持續(xù)分泌，這導(dǎo)致了吞噬細(xì)胞釋放的ROS的過量產(chǎn)生［66］。這也為研究PRRSV誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥和與氧化應(yīng)激之間的復(fù)雜關(guān)系提供了線索。