MicroRNA-409-3p通過靶向ZEB1促進(jìn)HCMV感染的膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的機(jī)制研究

余波 張丙旭 鐘文靜 王斌 錢冬萌 胡明

摘要：近年來的臨床研究顯示人巨細(xì)胞病毒（HCMV）與神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)系密切，但HCMV促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的機(jī)制仍未闡明，而microRNA（miRNA）在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中被檢測到異常表達(dá)，因此提出潛伏感染的HCMV會(huì)通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞miRNA從而影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的假設(shè)。首先通過轉(zhuǎn)錄組分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證實(shí)miR-409-3p在HCMV感染后顯著下調(diào)。生物信息學(xué)預(yù)測顯示鋅指結(jié)合蛋白1（ZEB1）為其下游靶基因。miR-409-3p過表達(dá)后的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-409-3p的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致ZEB1下調(diào)并抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞遷移，而外源性過表達(dá)ZEB1可恢復(fù)U87細(xì)胞遷移能力。研究結(jié)果表明，潛伏感染的HCMV能夠通過下調(diào)宿主細(xì)胞中miR-409-3p，從而上調(diào)ZEB1表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移。

關(guān)鍵詞：人巨細(xì)胞病毒;microRNA-409-3p;ZEB1;膠質(zhì)瘤

中圖分類號(hào)：R373.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-1037（2021）03-0056-07

人巨細(xì)胞病毒（HCMV），也稱為人皰疹病毒5（HHV-5），屬于皰疹病毒科的β亞科，是一種大多數(shù)人體內(nèi)均存在的雙鏈DNA病毒[1]。據(jù)報(bào)道，40%和95%的人被HCMV感染，但由于HCMV的復(fù)制受到自身免疫系統(tǒng)的限制，所以在人體中常為潛伏狀態(tài)[2]。但作為重要的臨床病原體，HCMV可以在免疫抑制或免疫功能低下的患者體中重新激活，導(dǎo)致患者疾病進(jìn)一步發(fā)展，甚至死亡[3]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是世界上最常見的惡性腦腫瘤，其顯著特點(diǎn)是彌漫性浸潤，轉(zhuǎn)移率高，生存結(jié)果極差[4]，且臨床治療效果不佳，預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高。2002年，Cobbs首次報(bào)道HCMV可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤有關(guān)[5]，隨后研究人員發(fā)現(xiàn)更昔洛韋（一種病毒DNA合成抑制劑）對神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者有明顯的治療作用[6]，以及HCMV感染可通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵致癌信號(hào)通路的活性來促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[7-8]，并通過干擾p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Rb，一種抑癌基因）抑制HCMV感染的細(xì)胞的凋亡[9]。然而，HCMV感染與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的具體發(fā)生機(jī)制仍不明確。越來越多的研究表明，微小RNA（miRNA）作為一種單鏈非編碼RNA，一類新的內(nèi)分泌因子[10-11]，在所有真核細(xì)胞或病毒中表達(dá)，并在轉(zhuǎn)錄后通過與下游靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[12-13]。研究表明神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miRNA表達(dá)失調(diào)[14]，miRNA與HCMV之間也有著密切的關(guān)聯(lián)[15]。在HCMV感染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miRNA的表達(dá)顯著改變[16]，但關(guān)于HCMV感染期間的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miRNA的表達(dá)和功能的認(rèn)識(shí)還相對缺乏。ZEB1是一個(gè)以鋅指簇結(jié)構(gòu)為特征，負(fù)責(zé)與CAGGTA盒狀啟動(dòng)子元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子[17-18]，ZEB1在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞功能（例如細(xì)胞存活、分化、增殖、衰老和凋亡）中起著至關(guān)重要的作用[19]。ZEB1在人類癌癥組織中異常表達(dá)與細(xì)胞遷移、侵襲、腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]。本研究擬討論miR-409-3p/ ZEB1信號(hào)通路在HCMV感染的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中的作用，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)診斷和治療提供新的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，U87，T98由本實(shí)驗(yàn)室保存。于37℃，5%CO2無菌條件下培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)。HCMV為ADl69株，使用人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）擴(kuò)增病毒，并使用軟瓊脂法定量病毒滴度。

1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清（FBS，Biological Industries），DMEM/F12（Biological Industries），MEM（Biological Industries），二甲基亞砜（DMSO，索萊寶），細(xì)胞RNA提取試劑盒（天根），cDNA合成試劑盒（諾唯贊），Transwell小室（康寧），IE86抗體（abcam），ZEB1抗體（博奧森），ACTIN抗體（博奧森），pp65抗體（博奧森） ，Real-time PCR儀（Bio-Rad iQ5）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）細(xì)胞培養(yǎng)。在37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清的MEM（培養(yǎng)液進(jìn)行人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（T98，U251和U87）培養(yǎng)。

（2）RNA提取，文庫構(gòu)建和測序。使用TRIzol提取每個(gè)樣品的總RNA。通過PAGE凝膠純化特定大小的microRNA分子。RNA-seq文庫通過6個(gè)步驟構(gòu)建：連接5'RNA接頭;連接3’RNA適配器;通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA測序文庫;通過高保真聚合酶擴(kuò)增構(gòu)建測序文庫; DNA擴(kuò)增;在Illumina HiSeq2500上測序。

（3）螢光素報(bào)告測定。分別構(gòu)建包含ZEB1 3'-UTR區(qū)域或3'-UTR突變區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pMIR-3'-UTRWt和pMIR-3'-UTRMut）。將pMIR-3'-UTRWt或pMIR-3'-UTRMut質(zhì)粒與miRNA模擬物共轉(zhuǎn)染到U87細(xì)胞中。48小時(shí)后，用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測miR-409-3p和ZEB1之間的結(jié)合效率。

（4）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種在6孔板中，并培養(yǎng)至70%匯合，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，48小時(shí)后，用200μL吸頭刮擦細(xì)胞層，然后用PBS沖洗，無血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，在倒置顯微鏡下拍攝。

（5）Transwell試驗(yàn)。將含有20%FBS的MEM添加到24孔板的底部，用無血清MEM將細(xì)胞重懸，接種于24孔板中的Transwell小室中，密度為5×105個(gè)細(xì)胞/mL，培養(yǎng)6小時(shí)后，將Transwell小室膜用甲醇固定15分鐘，然后用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)選擇五個(gè)視野（100倍），拍照計(jì)數(shù)。

（6）總RNA提取和定量RT-PCR（qRT-PCR）。用總RNA提取試劑盒從細(xì)胞系中提取總RNA。使用SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，以GAPDH表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。ZEB1（forward：5'- AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT -3'，reverse：5'-TGCACCTTCTGTCTCGGTTTCTT -3'）和GAPDH（forward：5'-GAGTCAACGGATTTGGTC G-3'， reverse：5'-TGGAAGATGGTGATGGGA-3'）。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算表達(dá)倍數(shù)變化。

（7）Western blot。將細(xì)胞總蛋白液與上樣緩沖液混合，95°C加熱5分鐘。在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離樣品后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的奶粉封閉2小時(shí)，一抗4℃過夜：兔抗ZEB1（1∶1 000），兔抗IE86（1∶1 000），兔抗pp65（1∶1 000）和兔抗ACTIN（1∶1 000）。用辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的抗兔二抗1∶5 000的稀釋，室溫結(jié)合一抗2小時(shí)，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，ImageJ軟件分析蛋白質(zhì)條帶。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 RNA-Seq揭示miR-409-3p在HCMV感染的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)

為了研究HCMV感染后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miRNA的表達(dá)情況，采用RNA-Seq技術(shù)對HCMV感染后的U87細(xì)胞中miRNA進(jìn)行測序。使用small RNA Sample Pre Kit試劑盒構(gòu)建文庫，由于Small RNA的5'端有磷酸基團(tuán)，3'端有羥基，利用T4 RNA Ligase 1和T4 RNA Ligase 2（truncated）分別在small RNA 5'端和3'端連接上接頭，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用Illumina HiSeq2500（單端50 nt）將構(gòu)建好的測序文庫進(jìn)行測序。每個(gè)樣品的clean data均大于11 M，Q30百分率超過97.79%。將過濾后的clean data與Silva，GtRNAdb和Rfam比對，去除核糖體RNA和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA。然后使用miRDeep2程序?qū)⑽醋⑨尩呐c由人（GRCh38_100，Ensembl）和HCMV菌株AD169完整基因組（gb：FJ527563）組成的索引進(jìn)行比對，確定每種miRNA的表達(dá)量，并使用每百萬轉(zhuǎn)錄本（TPM）標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量。DEGseq用于分析組之間的差異。

以| log2（FC）|≥1和FDR≤0.01作為差異表達(dá)miRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)，倍數(shù)變化（FC）代表兩個(gè)樣品組之間表達(dá)水平的比率。共鑒定出1 395個(gè)miRNA，為了研究HCMV感染對U87細(xì)胞中miRNA表達(dá)的潛在影響，在感染和模擬感染的細(xì)胞中鑒定出了差異表達(dá)的miRNA。根據(jù)兩組的miRNA表達(dá)的火山位點(diǎn)圖可知（圖1），與模擬感染組相比，感染后，有30個(gè)miRNA被下調(diào)，4個(gè)miRNA被上調(diào)。在全面分析LogFC，F(xiàn)DR和miRNA功能預(yù)測后，選擇了miR-409-3p（log2FC = -4.38，F(xiàn)DR = 0）。此外，通過靶基因預(yù)測（TargetScan：http：//www.targetscan.org/）分析，ZEB1與miR-409-3p種子序列能夠結(jié)合，且最小自由能小，結(jié)合穩(wěn)定性高，ZEB1很可能是 miR-409-3p的靶基因（圖2）。

2.2 在膠質(zhì)瘤U87中驗(yàn)證HCMV感染后miR-409-3p的表達(dá)，及靶向調(diào)節(jié)ZEB1

通過qRT-PCR檢測miR-409-3p、ZEB1分別在HCMV感染與未感染的U251，U87和T98細(xì)胞中的表達(dá)水平。miR-409-3p在HCMV感染的U251，U87和T98細(xì)胞中顯示低水平（圖3（a），P <0.05），而ZEB1 mRNA（圖3（b），P <0.05）和蛋白質(zhì)（圖4（a）、圖4（b），P <0.05）表達(dá)顯著增加，這些觀察結(jié)果表明miR-409-3p的下調(diào)與HCMV感染的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的ZEB1表達(dá)可能相關(guān)。接下來，在U87細(xì)胞中，將野生型/突變型ZEB1熒光素酶報(bào)告載體（pEF1α-3'-UTRWt和pEF1α-3'-UTRMut）與miR-409-3p mimic/miR-NC共轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)48小時(shí)，然后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測，顯示pEF1α-3'-UTRWt與miR-409-3p mimic共轉(zhuǎn)染組螢光素酶活性最低（圖5），螢光素酶活性在3'-UTRMut組中沒有受到影響。這些結(jié)果證實(shí)，miR-409-3p直接靶向U87細(xì)胞中ZEB1的3'-UTR。

2.3 MiR-409-3p的過表達(dá)和ZEB1的回復(fù)顯著改變了HCMV感染的U87細(xì)胞的遷移能力

IE86是HCMV感染后表達(dá)的重要即刻早期調(diào)控蛋白。通過IE86最高表達(dá)量選擇最佳感染時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示72小時(shí)為最佳感染時(shí)間點(diǎn)（圖6）。在HCMV感染的U87細(xì)胞中過表達(dá)miR-409-3p，劃痕試驗(yàn)顯示，miR-409-3p過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力降低（圖7、圖8（a）），相似的，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-409-3p過表達(dá)組細(xì)胞的遷移能力降低（圖7、圖8（b））。此外，qRT-PCR（圖9）和Western blot（圖10）顯示，miR-409-3p過表達(dá)組ZEB1的mRNA和蛋白水平顯著降低;隨后，將沒有3'-UTR的全長ZEB1克隆與miR-409-3p共轉(zhuǎn)染到HCMV感染的U87細(xì)胞中，對ZEB1進(jìn)行qRT-PCR和Western blot分析，發(fā)現(xiàn)ZEB1表達(dá)得以恢復(fù)（圖9、圖10）。同時(shí)，Transwell和劃痕試驗(yàn)的結(jié)果表明ZEB1回復(fù)組的遷移能力也被明顯恢復(fù)（圖7、圖8）。這些結(jié)果表明恢復(fù)ZEB1表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)由miR-409-3p過表達(dá)引起的遷移能力抑制現(xiàn)象。

2.4 討論

隨著研究的深入，miRNA在致癌和腫瘤惡性進(jìn)展中的作用受到越來越多的關(guān)注[21-22]，miRNA在多種因素影響下均可異常表達(dá)，病毒是其中重要的影響因素之一，而HCMV病毒對神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞普遍易感。根據(jù)研究報(bào)道，miR-409-3p在不同類型的癌癥中發(fā)揮重要作用，例如通過調(diào)節(jié)Beclin-1來增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[23]，靶向并抑制胃癌中的PHF10作為腫瘤抑制因子[24]，靶向c-Met抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移[25]，靶向連環(huán)蛋白δ1抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移[26]等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-409-3p在HCMV感染的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中也異常表達(dá)，并且可以通過作用于ZEB1進(jìn)而調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。

3 結(jié)論

在HCMV感染膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果提示miR-409-3p的表達(dá)下降，并發(fā)現(xiàn)ZEB1為miR-409-3p靶基因，過表達(dá)miR-409-3p和導(dǎo)敲低ZEB1均可以使細(xì)胞遷移能力降低，而在miR-409-3p過表達(dá)中回復(fù)ZEB1表達(dá)的細(xì)胞中，細(xì)胞遷移能力得到一定程度恢復(fù)，綜上表明，HCMV感染的U87細(xì)胞可以通過降低miR-409-3p表達(dá)導(dǎo)致ZEB1表達(dá)增強(qiáng)從而使細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。有研究表明ZEB1可以抑制E-cadherin的表達(dá)[27]，并進(jìn)一步誘導(dǎo)EMT，EMT被認(rèn)為是促進(jìn)癌細(xì)胞遷移并導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，而該機(jī)制是否也存在于HCMV感染的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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