船舶壓載水快速檢測方法的研究進展

李超 張燊

摘要：船舶壓載水引發(fā)的生物入侵問題日益嚴重。通過對浮游生物典型檢測方法的分析，對比了不同壓載水檢測方法的技術(shù)特點。基于不同使用環(huán)境下壓載水檢測要求，闡述了不同環(huán)境因素下選擇壓載水檢測形式的方法和原則。結(jié)合目前船舶壓載水檢測的形勢和需求，展望了壓載水檢測方法的發(fā)展趨勢。建議今后實踐應(yīng)用中需要根據(jù)壓載水類型和處理要求靈活選擇檢測手段，尤其是以數(shù)字全息技術(shù)為代表的原位檢測技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：壓載水;浮游生物;快速檢測;數(shù)字全息

中圖分類號：X55 文獻標志碼：A

文章編號：1006-1037（2021）03-0009-05

壓載水（Ballast Water）是指船舶在航行過程中為控制船舶橫傾、縱傾、吃水、穩(wěn)性或應(yīng)力而加裝到船上的水及懸浮物質(zhì)。船舶壓載水中含有大量生物體，包括浮游植物、浮游動物、海洋細菌、噬菌體等。這些生物被吸入壓載艙后相當于處在一個封閉狀態(tài)下的生態(tài)系統(tǒng)中，大部分因為無法適應(yīng)溫度、鹽度等因素的變化和壓載水處理系統(tǒng)的脅迫而死亡，但有的仍然能夠生存下來。這一部分經(jīng)過馴化并存活的生物往往具有極強的生命力和競爭力，一旦排放到適宜的環(huán)境中，就可能發(fā)生不可控制的“雪崩式”繁殖，引起生物入侵[1-4]。據(jù)國際海事組織（International Maritime Organization，IMO）資料，每年約有10億噸船舶壓載水被搬運，每天可有3 000多種動植物隨壓載水被運到世界各地不同海域，這導(dǎo)致全球多個港口時刻面臨生物入侵的威脅。而且壓載水中的生物不像其他污染物可被清除或吸收，一旦入侵和落戶當?shù)厮?，幾乎無法消除，帶來巨大的生態(tài)災(zāi)難。避免船舶壓載水排放所帶來的生物入侵問題，關(guān)鍵在預(yù)防，重點是壓載水的處理和檢測，壓載水排放前的檢測更是重中之重。目前壓載水檢測方法多種多樣，各有側(cè)重，各個港口國負責壓載水檢測的部門和人員往往不具備專業(yè)的生物學知識，很難根據(jù)實際情況選擇合適的壓載水檢測方法。本文基于現(xiàn)有的壓載水排放、檢測要求，對比分析通用的檢測方法，篩選出先進可靠的壓載水檢測技術(shù)，為操作人員選擇合適的壓載水檢測方法并防止生物入侵提供參考依據(jù)。

1 《壓載水公約》對壓載水排放和檢測的要求

為防止船舶壓載水中水生物的擴散對海洋環(huán)境造成毀滅性打擊，國際海事組織（IMO）于2004年召開的國際船舶壓載水管理大會通過了《國際船舶壓載水和沉積物控制與管理公約》（以下簡稱《壓載水公約》），該公約已于2017年9月8日正式生效。公約規(guī)定，壓載水管理的標準有兩種：D-1標準（壓載水交換標準）和D-2標準（壓載水處理性能標準）。D-1標準要求船舶在深海用3倍壓載水艙室容積的水對原有壓載水進行置換，因為深海中的水即使攜帶某些水生生物，被排到接收港水域后，水生生物一般因生存條件的差異而不易存活，從而降低或者避免了通過壓載水引入外來有害生物的風險。D-2標準具體規(guī)定了處理過的壓載水的排放標準，如表1所示。由于壓載水的取樣和分析技術(shù)性極強且分析指標要求高，IMO沒有對壓載水的浮游生物檢測方法進行明確規(guī)定。目前雖有成熟的商品化海洋生物定量分析儀器，但均存在應(yīng)用局限，如占用空間龐大，測試耗時長，需專業(yè)人員操作，無法辨識細胞死活等[5-6]。

2 壓載水中浮游生物典型檢測方法的比較

壓載水中生物體的快速識別、計數(shù)和死活判別，一直是海洋科技工作者努力的目標。傳統(tǒng)的海洋浮游生物檢測手段，如顯微鏡計數(shù)法既費時、費力且專業(yè)性要求較高，在實際監(jiān)測中已很少使用[7]。近年來，出現(xiàn)了一些較為先進的壓載水檢測方法，根據(jù)其原理，可分為染色法、熒光特性檢測法、流式細胞法、光學成像檢測法等。

（1） 染色法。根據(jù)染色劑的類型可分為化學染色法和熒光染色法，都是利用染色劑對細胞不同部位的親和性差異，達到標記細胞的目的?；瘜W染色法最常用的染色劑是臺盼藍和中性紅，能夠穿過受損的細胞膜進入細胞，而對于正常的細胞則無法穿透，從而實現(xiàn)對活細胞和死細胞的區(qū)分[8-9]。熒光染色法常用的染色劑有FDA（雙醋酸熒光素）和PI（碘化丙錠）[10]。FDA本身不發(fā)熒光，但該染料可被活細胞中的非特異性酯酶分解產(chǎn)生熒光物質(zhì)，從而使細胞發(fā)熒光。死亡細胞或活性較差的細胞中由于非特異性酯酶活性差，因此無熒光或熒光較暗[11]。PI則與細胞內(nèi)DNA和RNA物質(zhì)相作用生成紅色熒光物，使死亡細胞發(fā)出紅色熒光[12]。借助兩種熒光染色劑的配合使用還可以實現(xiàn)細胞不同死亡類型和死亡階段的區(qū)分[13]。相比傳統(tǒng)的化學染色法，熒光染色法的靈敏度更高，但鑒別過程依舊需要借助熒光顯微鏡，單次僅能檢測微量樣品，難以實現(xiàn)高通量。染色法過程中操作不當還容易導(dǎo)致假陽性或假陰性，準確度較低。無論是化學染色法還是熒光染色法，都需要配合顯微鏡進行計數(shù)，而且染色過程需要一定的反應(yīng)時間，在壓載水快速檢測中并不具備明顯優(yōu)勢。

（2） 熒光特性檢測法。海水中的生物體絕大多數(shù)是浮游植物，葉綠素a廣泛存在于浮游植物細胞中而且具有特殊的吸收光譜。通過對葉綠素a的測量可以得知浮游植物細胞的豐度。葉綠素a濃度的測定有多種方法，其中常用的有分光光度法、熒光光譜法、高效液相色譜法（HPLC）和吸收光譜法等。這一類方法靈敏度較低，而且測得的結(jié)果只是葉綠素a的含量，有研究表明葉綠素a在藻類死亡兩周后仍能檢測到[14]，也就是說葉綠素a含量并不能和活體藻細胞的濃度準確對應(yīng)，無法和《壓載水公約》進行直接對比。

（3） 流式細胞法。流式細胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）出現(xiàn)于20世紀70年代，是一種集流體驅(qū)動原理、激光測量技術(shù)和計算機分析于一體的技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對單個生物細胞的定量分析和分選，精確分析細胞的大小、形態(tài)、葉綠素含量和內(nèi)容物等參數(shù)。流式細胞儀，是一種比較成熟的檢測手段，已廣泛應(yīng)用在生物、醫(yī)學和環(huán)境檢測等諸多領(lǐng)域[15-17]。近年來，該技術(shù)更是和微流控技術(shù)相結(jié)合，改良進樣方式，增強了可操作性[18]。但在壓載水檢測應(yīng)用中測仍存在局限?！秹狠d水公約》要求的存活水生物濃度很低，需要檢測數(shù)升水樣才能確保測量結(jié)果的準確性，而流式細胞儀的進樣量一般在微升量級，無法直接用其檢測壓載水，需要配合濃縮手段，這就增加了時間成本。

（4） 分子生物學方法。利用分子生物學手段，如PCR技術(shù)、細胞雜交技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)等，來實現(xiàn)海洋浮游生物的精確檢測[19]。優(yōu)勢在于能夠準確檢測出特定種類的生物遺傳信息，對《壓載水公約》規(guī)定的三種指示病原微生物（產(chǎn)毒霍亂弧菌、大腸桿菌、腸球菌）的檢出應(yīng)用效果良好。但對實驗條件要求高，反應(yīng)速度慢，目前還停留在實驗室檢測階段，短期內(nèi)難以實現(xiàn)現(xiàn)場檢測。

（5） 光學成像法。利用水下成像系統(tǒng)對浮游生物進行直接的圖像記錄是觀測海洋浮游生物最直觀的方法，需要配合圖像處理算法，根據(jù)藻細胞的大小、形態(tài)和運動特征等信息，達到對微藻的識別和分類的目的。這類方法要想在壓載水檢測中發(fā)揮良好效用需要滿足兩個條件：分辨率要夠高，圖像處理算法要足夠智能。《壓載水公約》中不僅規(guī)定了微米級生物的含量，而且要求指示生物的含量也要達標，產(chǎn)毒霍亂弧菌、大腸桿菌、腸球菌的直徑均在亞微米級?，F(xiàn)有的浮游生物掃描系統(tǒng)，如Zoo Scan只適用于研究200 μm以上的浮游動物[20-21]，并不適用于壓載水的檢測。單張圖像往往包含了眾多種類的浮游生物，如何在無人為干預(yù)的情況下將它們準確區(qū)分和計數(shù)，是光學成像法亟待解決的問題。另外，如果算法不夠智能，則又會落入傳統(tǒng)顯微鏡檢查的窠臼。

光學成像法中最具發(fā)展前景的是數(shù)字全息技術(shù)（Digital Holography），這是一種兩步成像法：波前記錄和波前再現(xiàn)[22]。一束波長已知的參考光照射到目標物，產(chǎn)生衍射光波，衍射光波與未被衍射的參考光相互疊加干涉，產(chǎn)生包含物光波波前相位和振幅的干涉圖樣，再將這些干涉圖像通過電子成像器件存儲在計算機中，這是波前記錄過程。用計算機模擬衍射過程，還原被測物體的物光波前，得到符合人眼視覺的三維影像，這一過程叫做波前再現(xiàn)（見圖1）。數(shù)字全息技術(shù)可同時獲得物光場的振幅和相位信息，能夠在非接觸無標記的情況下對活體細胞進行真三維定量觀測，獲得細胞的三維形貌[22]。目前，數(shù)字全息顯微的分辨率已經(jīng)達到幾微米甚至亞微米量級，完全可以滿足大多數(shù)浮游生物的觀測需求[23]。另外，通過對全息圖的相位分析，可以獲得光在經(jīng)過藻細胞之后的相移信息。由于相移是由細胞內(nèi)不同組分及細胞外組織液的細微折射率變化引起的，藻細胞死亡后胞內(nèi)物質(zhì)外泄，活細胞和死細胞的相移信息具有明顯差別[24-25]?；谏鲜鲈?，數(shù)字全息技術(shù)還能夠精確判別藻細胞的活性[26-27]。這一點和《壓載水公約》防止生物入侵的初衷剛好契合。近年來，數(shù)字全息技術(shù)發(fā)展迅速，隨著深度學習等智能圖像識別算法的不斷優(yōu)化，對部分藻類的識別準確率已經(jīng)能夠達到90%以上[28-29]。但這種方法運算量大，對圖像的質(zhì)量有很高的要求，因此還需要不斷優(yōu)化圖像處理和智能識別算法。

除上述幾個具有代表性的檢測方法外，還有培養(yǎng)計數(shù)法等傳統(tǒng)方法?！秹狠d水公約》還規(guī)定，港口國在對船舶壓載水進行取樣和分析的過程中不得造成船舶的不當延誤，一旦因極特殊原因造成船舶延誤，將導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失[30]。這就對船舶壓載水檢測方法的時效性提出了更高的要求，響應(yīng)時間也成為了一個必須要考慮的因素。典型壓載水檢測方法的優(yōu)缺點和響應(yīng)時間如表2所示[31-35]。

從表2所列壓載水檢測手段對比可以看出，現(xiàn)有的壓載水檢測方法原理不一，各有側(cè)重點。在實際檢測中，需要根據(jù)船舶配備的壓載水處理系統(tǒng)類型、航行軌跡、航行時間、航行日志、港口水文狀況和容許檢測時間等因素有的放矢地選擇一種或幾種進行檢測，才能最大程度降低生物入侵風險同時避免人力物力的浪費。如在赤潮多發(fā)海域，需要重點檢測壓載水中是否含有本地高發(fā)的赤潮藻種，采用流式細胞法更加快速準確;在養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達的海域，需要重點監(jiān)測對海水養(yǎng)殖有害的生物，采用光學成像法能夠更全面地獲取壓載水中的生物種類。傳感器技術(shù)、電池技術(shù)、計算技術(shù)[36]和新材料的快速發(fā)展，帶動三維成像、全息成像與圖像智能識別算法的進步，以圖像智能識別[37-38]和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法（Convolutional Neural Network，CNN）為代表的多重神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法[39-41]也逐漸被應(yīng)用到壓載水檢測中。壓載水檢測設(shè)備逐漸朝著集成化、小型化、低耗能、快速響應(yīng)、抗干擾等方向發(fā)展。

目前數(shù)字全息技術(shù)在浮游植物檢測領(lǐng)域的研究應(yīng)用方興未艾。大連海事大學的王俊生教授團隊在數(shù)字全息成像裝置的基礎(chǔ)上，配合微流控技術(shù)進行樣品預(yù)處理，設(shè)計了一臺小型化壓載水檢測平臺。該平臺使用全息衍射條紋的中心亮斑和第一級暗條紋的面積和灰度值作為評價藻細胞活性的關(guān)鍵參數(shù)，能夠?qū)狠d水中的藻類進行活性分析，但采用的參數(shù)過于單一，準確度不高[42]。山東大學的研究團隊則更加注重對藻細胞全息圖像進行重構(gòu)后的振幅和相位變化分析，并從中提取了多個特征值，利用機器學習算法實現(xiàn)了藻細胞活性的自動判別[43]。

3 結(jié)論

隨著船舶壓載水處理逐步受到重視，壓載水檢測方法和手段逐步呈現(xiàn)多樣化。實際應(yīng)用中，需要根據(jù)壓載水類型和處理要求，選用不同的檢測方法和手段。目前，壓載水的檢測方法和手段普遍存在檢測時間長、靈敏度低、可操作性差、檢測結(jié)果不夠直觀等問題。以數(shù)字全息技術(shù)為代表的真三維、非入侵成像方法和以卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法（CNN）為代表的智能圖像處理算法的有機結(jié)合，在壓載水快速檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。特別是蓬勃發(fā)展的智能圖像處理算法，與傳統(tǒng)的圖形類檢測方法相比，它能夠直接從圖像像素中提取特征值，處理方式更加接近人類大腦視覺系統(tǒng)的處理方式，為解決現(xiàn)有檢測方法和手段存在的弊端提供了有效的解決思路。

參考文獻

[1]DRAKE J M， LODGE D M. Global hot spots of biological invasions： Evaluating options for ballast-water management[J]. Proceedings of The Royal Society B：Biological Sciences， 2004， 271（1539）： 575-580.

[2]齊艷紅，趙映慧，殷秀琴. 中國生物入侵的生態(tài)分布[J]. 生態(tài)環(huán)境， 2004， 13（3）： 414-416.

[3]DRAKE L A，MEYER A E，F(xiàn)ORSBERG R L，et al. Potential invasion of microorganisms and pathogens via ′Interior Hull Fouling′： Biofilms inside ballast water tanks[J]. Biological Invasions， 2005， 7（6）： 969-982.

[4]劉芳明，繆錦來，鄭洲，等. 中國外來海洋生物入侵的現(xiàn)狀、危害及其防治對策[J]. 海岸工程， 2007， 26（4）： 49-57.

[5]WANG J S，F(xiàn)AN Z Q， ZHAO Y L，et al. A new hand-held microfluidic cytometer for evaluating irradiation damage by analysis of the damaged cells distribution[J]. Science Report， 2016， 6： 23165.

[6]WANG J S， SONG Y N， MAW M M， et al. Detection of size spectrum of microalgae cells in an integrated underwater microfluidic device[J]. Journal of Experimental Marine Biology & Ecology， 2015， 473：129-137.

[7]黨坤，宋家慧，趙殿榮， 等. 船舶壓載水問題綜述[J]. 航海技術(shù)， 2001， （4）： 60-63.

[8]王帥，張波，趙昔龍，等. 適合海洋微藻活體染色的方法評價[J]. 海洋科學進展， 2018， 36（2）： 321-330.

[9]PICCININI F， TESEI A， ARIENTI C， et al. Cell counting and viability assessment of 2D and 3D cell cultures： Expected reliability of the trypan blue assay[J]. Biological Procedures Online， 2017， 19（1）：8.

[10] HOLMSTRUP M E， HAECKY P， BLACKBURN N. Preliminary verification studies of the motility and fluorescence assay （MFA） for ballast water quality monitoring[J]. Journal of Sea Research， 2020， 159：101889.

[11] GARVEY M， MORICEAU B， PASSOW U. Applicability of the FDA assay to determine the viability of marine phytoplankton under different environmental conditions[J]. Marine Ecology Progress， 2011， 352（12）：17-26.

[12] 譚曉華，張亞歷，姜泊，等. PI染色流式細胞儀檢測細胞凋亡的影響因素[J]. 第一軍醫(yī)大學學報， 2000， 20（4）： 344-346.

[13] 祁愛群，錢凱先，邵健忠，等. FDA-PI雙色熒光分光光度法檢測細胞活性變化[J]. 細胞生物學雜志， 2000， 22（1）： 50-52+57.

[14] STEINBERG M K，LEMIEUX E J， DRAKE L A. Determining the viability of marine protists using a combination of vital， fluorescent stains[J]. Marine Biology， 2011， 6（158）： 1431-1437.

[15] 張新莉，楊曉莉，潘玙璠，等. 流式細胞儀檢測微細膠黏物中尼羅紅染料選擇性吸附的研究[J]. 中國造紙， 2020， 39（2）： 27-32.

[16] 吳建勇，趙德璋. 流式細胞儀檢測細胞凋亡的幾種方法的比較[J]. 重慶醫(yī)科大學學報， 2010， 35（9）： 1386-1389.

[17] DUNKER S. Imaging flow cytometry for phylogenetic and morphologically based functional group clustering of a natural phytoplankton community over 1year in an urban pond[J]. Cytometry Part A， 2020， 97A： 727-736.

[18] 穆莉莉，侯麗雅，章維一. 基于微流體數(shù)字化技術(shù)的流式細胞術(shù)的設(shè)計[J]. 化工學報， 2010， 61（4）： 949-954.

[19] HARVEY J B J，HOY M S，RODRIGUEZ R J. Molecular detection of native and invasive marine invertebrate larvae present in ballast and open water environmental samples collected in puget sound[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology， 2009， 369（2）： 93-99.

[20] 代魯平，李超倫，王世偉，等. 基于ZooScan圖像技術(shù)的南黃海夏季浮游動物群落結(jié)構(gòu)分析[J]. 海洋與湖沼， 2016， 47（4）： 764-773.

[21] 孫曉霞，孫松. 海洋浮游生物圖像觀測技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 地球科學進展， 2014， 26（6）： 748-755.

[22] XU W， JERICHO M H， MEINERTZHAGEN I A， et al. Digital in-line holography of microspheres[J]. Applied Optics， 2002， 41（25）：5367-5375.

[23] 郜鵬，溫凱，孫雪瑩，等. 定量相位顯微中分辨率增強技術(shù)綜述[J]. 紅外與激光工程， 2019， 48（6）： 81-93.

[24] VICAR T， RAUDENSKA M， GUMULEC J， et al. The quantitative-phase dynamics of apoptosis and lytic cell death[J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 1566.

[25] MACHADO M D，SOARES E V. Quantification and viability analyses of Pseudokirchneriella subcapitata algal cells using image-based cytometry[J]. Journal of Applied Phycology， 2015， 27（2）： 703-710.

[26] BAKER K L，BOUCHER K M， JUDSON-TORRES R L， et al. Label-free classification of apoptosis， ferroptosis and necroptosis using digital holographic cytometry[J]. Applied Sciences， 2020， 10： 4439.

[27] MACIEL D， VERES S P， KREUZER H J， et al. Quantitative phase measurements of tendon collagen fibres[J]. Journal of Biophotonics， 2017， 10（1）： 111-117.

[28] WANG J S， MAW M M， YU X M， et al. Applications and perspectives on microfluidic technologies in ships and marine engineering： A review[J]. Microfluidics & Nanofluidics， 2017， 21（3）：1-16.

[29] GO T， BYEON H， LEE S J. Label-free sensor for automatic identification of erythrocytes using digital in-line holographic microscopy and machine learning[J]. Biosensors & Bioelectronics， 2018， 103：12-18.

[30] 章奇林，孫玉杰. 壓載水管理缺陷滯留案例分析[J]. 世界海運， 2020， 43（5）： 44-47.

[31] CASAS-MONROY O，CHAN P S，LINLEY R D，et al. Comparison of three techniques to evaluate the number of viable phytoplankton cells in ballast water after ultraviolet irradiation treatment[J]. Journal of Applied Phycology， 2016， 28（5）： 2821-2830.

[32] DE CASTRO M C T，VELDHUIS M J W，F(xiàn)ILEMAN T W，et al. Different approaches and limitations for testing phytoplankton viability in natural assemblies and treated ballast water[J]. Marine Pollution Bulletin， 2018， 137： 172-179.

[33] GOLLASC H S，DAVID M. Algae viability over time in a ballast water sample[J]. Journal of Sea Research， 2018， 133： 112-114.

[34] 孟雄飛，王俊生，潘新祥. 船舶壓載水中微藻快速檢測系統(tǒng)設(shè)計[J]. 儀表技術(shù)與傳感器， 2016， （9）： 55-58.

[35] 王雨，林茂，林更銘，等. 流式影像術(shù)在海洋浮游植物分類研究中的應(yīng)用[J]. 海洋科學進展，2010， 28（2）： 266-274.

[36] 董水峰，柳林，張倩，等. 多源海洋數(shù)據(jù)綜合管理應(yīng)用平臺的研究與實現(xiàn)[J]. 青島大學學報（自然科學版）， 2017， 30（1）： 73-78.

[37] 陳作聰，宋武. 基于改進粒子群SVM的海洋赤潮監(jiān)測算法設(shè)計[J]. 青島大學學報（自然科學版）， 2016， 29（4）： 30-33.

[38] GO T， KIM J H， BYEON H， et al. Machine learning-based in-line holographic sensing of unstained malaria-infected red blood cells[J]. Journal of Biophotonics， 2018，11（9）： e201800101.

[39] LEE S J，YOON G Y，GO T. Deep learning-based accurate and rapid tracking of 3D positional information of microparticles using digital holographic microscopy[J]. Experiments in Fluids， 2019， 60（11）： 170.

[40] REIMANN R， ZENG B， JAKOPEC M， et al. Classification of dead and living microalgae Chlorella vulgaris by bioimage informatics and machine learning[J]. Algal Research， 2020， 48：101908.

[41] 生龍，馬建飛，楊瑞欣，等. 基于特征交換的CNN圖像分類算法研究[J]. 計算機工程， 2019， 46（9）： 274-279.

[42] WANG J S， YU X M，WANG Y J， et al. Detection of viability of micro-algae cells by optofluidic hologram pattern[J]. Biomicrofluidics， 2018， 12（2）： 024111.

[43] WANG Y Y， JU P， WANG S， et al. Identification of living and dead microalgae cells with digital holography and verified in the East China Sea[J]. Marine Pollution Bulletin， 2021， 163（4）：111927.