草魚Rab1A基因的克隆表達、抗體制備及對微囊藻毒素-LR的響應

何 麗 劉 林 阮記明 周 穎 梁惜梅 林長高 隗黎麗

(江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，江西 南昌 330045)

在真核生物中，小分子三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)結合蛋白家族是一類能夠結合GTP的蛋白質，該家族包括Ras、Rho、Rab (ras-associated binding-GTPase)、Sar/Arf 和Ran 5 個亞家族，Rab 是其中最大的亞家族[1]，它編碼的蛋白質以單體的形式存在，一般由200～210 個氨基酸組成，包含高度保守的GTPase 結構域、GTP/GDP 結合結構域和可變的N 端和C 端[2]。Rab 蛋白不僅對維持正確的細胞穩(wěn)態(tài)至關重要，而且對特定的細胞功能也非常重要[3]。不同的Rabs 蛋白是突觸囊泡運輸?shù)闹匾{節(jié)因子，在細胞增殖分子或是凋亡中發(fā)揮重要作用[4－5]。Rab 蛋白由鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEFs)激活[6]，其活性受到GTP 結合形式(活性狀態(tài))和GDP 結合形式(非活性狀態(tài))的嚴格調控[7]，激活的Rab 蛋白通過招募外殼蛋白、激酶、磷酸酶等效應分子觸發(fā)下游膜運輸事件[8－9]。

在人類中發(fā)現(xiàn)的Rab 蛋白至少有60 種[10]，其中，Rab1A 蛋白作為Ras 超家族的一員，最初被描述為高爾基體(Golgi-resident) Rab，參與內質網(wǎng)到高爾基體的運輸[11]。有研究表明，Rab1A 蛋白作為分子開關還可調節(jié)其他類型的細胞內轉運事件，如早期內吞囊泡的運動[12]。Rab1A 蛋白作為一種高度保守的蛋白質，已在158 種不同生物體中被發(fā)現(xiàn)[13]，但在魚類中報道較少[14]。草魚(Ctenopharygodon idella)屬鯉形目鯉科，是我國一種重要的淡水養(yǎng)殖魚類，2018年的總產(chǎn)量達到了5.5×109kg，占淡水養(yǎng)殖魚類總產(chǎn)量的21.63%[15]。近年來，由于投餌以及養(yǎng)殖密度的增加，極易造成養(yǎng)殖池塘的富營養(yǎng)，從而導致藍藻水華的暴發(fā)，隨之釋放到水環(huán)境中的微囊藻毒素(microcystins，MCs)對草魚會產(chǎn)生一定的脅迫。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的MCs 有100 多種異構體，其中最普遍且毒性較大的為微囊藻毒素-LR (microcystins-LR，MC-LR)[16]。

前期對MC-LR 誘導后的草魚肝臟進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)Rab1A基因有差異表達[17]。在此基礎上，本研究對Rab1A基因全長進行克隆、構建原核表達載體、制備多克隆抗體，并從轉錄水平和蛋白水平分析Rab1A經(jīng)MCs 異構體中的MC-LR 誘導后的表達變化，旨在為進一步探索草魚Rab1A基因在響應MC-LR 脅迫中的作用提供理論基礎，為深入研究草魚Rab1A 蛋白的結構和功能提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

草魚購自江西省南昌神龍漁業(yè)公司養(yǎng)殖基地，體重22.13±2.17 g，體長12.09±1.33 cm。草魚暫養(yǎng)于實驗室中，持續(xù)充氧，水溫20±0.2℃，光周期同自然光，暫養(yǎng)期間投喂商品飼料，日投餌量按體重的2%計算，早晚各1 次。暫養(yǎng)2 周后，取健康無傷的3 尾草魚，先尾靜脈取血，隨后分離鰓、皮膚、肌肉、肝、脾、腸道、體腎、心臟以及頭腎置于液氮中保存，用于草魚Rab1A組織分布特征分析。隨后將120 尾草魚隨機分組，包括1 個對照組和3 個處理組，每組設置3 個重復，每個重復包括10 尾魚，經(jīng)腹腔注射染毒，MC-LR劑量分別為0、25、75 和100 μg·kg－1，對照組注射等量生理鹽水，試驗期間沒有魚死亡。注射96 h 后，分別從各不同劑量的處理組和對照組中分別取6 尾魚分離肝臟樣品置于液氮保存，用于Rab1A基因及蛋白表達分析。

1.2 草魚Rab1A 基因cDNA 的克隆

取出保存于液氮中的肝臟用TRIzol (美國Invitrogen 公司)提取RNA，隨后用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit (美國Clontech 公司)進行反轉錄獲得cDNA 模板。根據(jù)草魚轉錄組測序的序列設計擴增草魚Rab1A基因的PCR 引物(Rab1A-MF:5′-GACTATTT ATTCAAGCTG-3′，Rab1A-MR:5′-TCAGCAGCAGCCTCC AGA-3′)，以肝臟cDNA 模板進行PCR 擴增，獲得Rab1A基因的中間片段。再根據(jù)得到的中間片段設計3′cDNA 末端快速擴增技術(rapid amplication of cDNA ends，RACE)(RC3－1:5′-CCAACGTGGAGCAGGCCTT C-3′，RC3－2:5′-ATGGGCCCCGGAGCCACAGC-3′)和5′-RACE(RC5－1:5′-GATGGTCTTTCCGTCT-3′，RC5－2:5′-TCCACACCAATAGTGCTAAT-3′，RC5－3:5′-GTGTC ATCTGCAAATCGG-3′)的特異性引物，根據(jù)SMARTTMcDNA Amplication Kit (美國Clontech 公司)的說明書進行3′RACE 和5′ RACE 擴增，分別獲得3′末端和5′末端序列，再與中間序列拼接得到Rab1A基因cDNA全長序列。

1.3 草魚Rab1A 基因cDNA 序列及系統(tǒng)進化分析

利用生物信息學在線工具對草魚Rab1A基因進行分析。利用NCBI(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 查找開放閱讀框(open reading frame，ORF)，并采用BLAST (http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行序列同源性分析，采用Expasy (http:/ /us.expasy.org/tools/protparam.Html)進行蛋白質理化性質的分析，跨膜結構和信號肽預測分別采用Phyre2(http:/ /www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) 和SignalP (http:/ /www.cbs.dtu.dk/services/SignalP－4.1)進行分析，結構域使用SMART (http:/ /smart.embl-heidelberg.de/)進行分析，氨基酸序列的比對用ClustalW1.81 軟件分析。從 GenBank 下載黃顙魚(Tachysurus fulvidraco)(XP027030811.1)、 電 鰻(Electrophorus electricus)( XP026873392.1 )、 斑馬魚 (Danio rerio)( NM001007161.1 )、 鯉魚 (Cyprinus carpio)( KF737068.1 )、 非洲爪蟾 (Xenopus laevis)(AAH45014.1)、西部錦龜(Chrysemys picta bellii)(XP005287289.1)、人(Homo sapiens)(EAW99923.1)和小鼠(Mus musculus)(BAE30098.1)氨基酸序列，采用Mega7.0 軟件的鄰接(neighbor-joining，NJ)法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 草魚Rab1A 基因組織分布及MC-LR 對其表達的影響

取保存于液氮中健康草魚的鰓、皮膚、肌肉、肝臟、脾臟、腸道、體腎、心臟、頭腎、血液以及經(jīng)不同劑量MC-LR 處理96 h 后的肝臟組織，先用TRIzol 提取RNA，采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(美國Promega 公司)進行反轉錄獲得cDNA 模板。根據(jù)獲得的草魚Rab1A基因cDNA 序列設計熒光定量引物(Rab1A-F:5′-AAGTCTTGCCTTCTTCTCCGAT-3′，Rab1A-R:5′-ACCTCTCTTGCCCTGCTGTATC-3′)，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRTPCR)方法檢測草魚Rab1A基因在不同組織中的表達水平以及MC-LR 染毒后的草魚肝臟中Rab1A基因的表達變化。其中，檢測Rab1A基因在不同組織中的表達的內參基因為β-actin(F: 5′-CCTTCTTGGGTAGGAG TCTTG-3′，R:5′-AGAGTATTTACGCTCAGGTGGG-3′)，分析MC-LR 對Rab1A基因表達的內參基因為甘油醛－3－磷酸脫氫酶( glyceraldehyde － 3phosphate dehydrogenase，GAPDH) (F:5′-AACTGAATCCTCTGTG TATCC-3′，R: 5′-GTCCGTTGTTGACCTCACCT-3′)，qRT-PCR 方法參考文獻[18]。

1.5 草魚Rab1A 原核表達載體構建及多克隆抗體制備

根據(jù)獲得草魚Rab1A基因ORF 序列，設計引物(F: 5′-ATGAATCCCGAATATGAC-3′，R:5′-GCAGCAG CCTCCAGATGCA-3′)，以肝臟cDNA 作為模板，進行PCR 擴增，擴增得到的產(chǎn)物亞克隆到pMD－18－T 并轉化到大腸桿菌DH5α。經(jīng)培養(yǎng)，取單克隆測序獲得表達正確的Rab1A序列。隨后選擇重組表達蛋白表達載體pGEX－4T－1，對載體和Rab1A基因的序列的限制性酶切位點進行分析，選擇BamHⅠ和SalⅠ作為載體構建的連接位點，在1～202 aa 這段序列內設計添加BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位點(下劃線標出)的引物(F:5′-CGGTAGCCATGAATCCCGAATATGAC-3′，R:5′-ACGCGTCGACTCAGCAGCAGCCTCCAGA-3′)。分別用BamHⅠ和SalⅠ對pGEX－4T－1 和pMD－18-TRab1A雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，再將Rab1A基因片段連接至pGEX－4T－1 載體，隨后將連接產(chǎn)物pGEX－4T－1－Rab1A轉化至BL21(DE3)中，挑選陽性菌落再次測序驗證，獲得pGEX－4T－1－Rab1A重組表達載體。將測序正確的菌液繼續(xù)培養(yǎng)，加入0.8 mol·L－1異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-Dthiogalactopyranosidem，IPTG)在37℃誘導4 h，將誘導完的菌液超聲破碎，分離上清與沉淀，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel，SDS-PAGE)分析，然后再將從上清獲得的蛋白進行純化。先后4 次皮下注射純化的蛋白免疫新西蘭兔子，于第1 次免疫52 d 后采血獲得抗血清。采用酶聯(lián)免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測抗血清效價，測定時以抗原包被液作為空白對照，未免疫的新西蘭大白兔血清作為陰性對照。以純化的重組蛋白為抗原，抗血清作為一抗(1 ∶1000 稀釋)，用稀釋3 000倍HRP 標記山羊抗兔IgG 為二抗，采用Western blot 進行特異性檢測分析。

1.6 微囊藻毒素對草魚Rab1A 蛋白表達的影響

取保存于液氮中的經(jīng)MC-LR 染毒的肝臟樣品，提取蛋白。蛋白樣品先用BCA 蛋白檢測試劑盒(武漢塞維爾生物科技有限公司)定量，隨后加入5×Loading buffer，充分混勻，沸水浴10 min 變性。蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍染色。采用電轉移系統(tǒng)轉至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國Millipore 公司)上，然后將膜浸沒在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。采用前述方法獲得的一抗[兔多抗Rab1A(1 ∶1000 稀釋)，選擇兔多抗GAPDH(武漢博士德生物工程有限公司)作為內參蛋白]孵育(4℃，8 h)，倒掉一抗稀釋液，用吐溫20 Tris 緩沖液(Tris buffered solution tween－20，TBST)洗滌3 次(每次10 min)，然后用稀釋3 000 倍HRP 標記山羊抗兔的二抗(武漢塞維爾生物科技有限公司)孵育(25℃，40 min)，再用TBST 洗滌3 次(每次10 min)，最后采用增強化學發(fā)光(enhanced chemi luminescence，ECL)法顯影、曝光并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，Rab1A基因在不同組織中的相對表達以及MC-LR 對Rab1A蛋白表達的影響均采用One-way ANOVA 分析(SPSS 16.0)，統(tǒng)計學顯著性水平設定P<0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 草魚Rab1A 基因全長cDNA 序列特征分析

根據(jù)草魚轉錄組測序得到一段長約570 bpRab1A基因的序列，設計引物對該段序列進行驗證并在NCBI上進行BLAST 分析，進一步確定為草魚Rab1A基因cDNA 的中間序列，隨后通過RACE 法擴增草魚Rab1A基因的5′末端和3′末端序列，分別獲得了長度為151 bp和234 bp 大小的產(chǎn)物。經(jīng)序列拼接獲得草魚Rab1A基因cDNA 全長序列，其在NCBI 的GenBank 登錄號為MG797687。草魚Rab1A基因全長806 bp，包括5′非編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)，分別為56 bp 和141 bp，ORF 為609 bp。對其編碼氨基酸序列預測分析，發(fā)現(xiàn)草魚Rab1A含有202 個氨基酸，分子量為22.34 kDa，理論等電點為5.93。采用signalP4.1 和Phyer2 在線分析未發(fā)現(xiàn)信號肽和跨膜結構。SMART 在線軟件分析發(fā)現(xiàn)在9～172 aa處為Rab 蛋白功能結構域，也具有Rab 蛋白家族成員的5 個保守的共有序列元件，分別為GDSGVGKS (15～22 aa)、T (40 aa)、DTAG(63～66 aa)、NKCD (121～124 aa)和SAK (151～153 aa) (圖1)。Rab1A基因編碼的蛋白質中還存在GTP/Mg2＋結合位點，分別為D (16 aa)、GVGKSC (18～23 aa)、Y(33 aa)、NK(121～122 aa)、D(124 aa)、SAK(151～153 aa)，GDP 解離抑制因子(GDP dissociation inhibitor，GDI)作用位點包括IG(41～42 aa)、D (44 aa)、WD(62～63 aa)、F(70 aa)、T(72 aa)、TSS(74 ～ 76 aa) 和R (79 aa)，開關Ⅰ(Switch Ⅰ:YTESYISTIGVDFK，33 ～ 46 aa) 和開關Ⅱ(Switch Ⅱ:GQERFRTITSSYY，66～78 aa) (圖1)。

2.2 草魚Rab1A 氨基酸同源性與系統(tǒng)進化分析

草魚Rab1A氨基酸與鯉魚和斑馬魚Rab1A氨基酸的相似性非常高，達99%。應用MEGA7.0 軟件構建的系統(tǒng)進化樹表明草魚Rab1A與鯉魚、斑馬魚、黃顙魚和電鰻等魚類的Rab1A氨基酸聚為一大支，其中與鯉魚的關系最近，而鳥類、哺乳動物和兩棲動物等的Rab1A聚為另一大支(圖2)。

2.3 草魚Rab1A 基因組織分布特征分析

對草魚頭腎、脾臟、體腎、皮膚、肌肉、肝臟、腸道、血液、心臟以及鰓9 種組織中Rab1A基因的表達進行qRT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)草魚Rab1A基因在所有檢測的組織中均有表達，其中在血液中的表達量最為豐富，其次為鰓、心臟、肝臟和肌肉等，在頭腎中表達量相對較低。以相對表達量最低的頭腎作為參照進行分析，結果發(fā)現(xiàn)血液、鰓、心臟、肝臟和肌肉中Rab1A基因的表達量顯著高于頭腎中的表達量(P<0.05) (圖3)。

2.4 Rab1A 重組蛋白的表達與純化

根據(jù)克隆獲得的Rab1A基因序列，構建重組表達載體pGEX－4T－1－Rab1A并轉入到表達宿主菌BL21，隨后采用0.8 mmol·L－1IPTG 誘導4 h，然后破菌分析蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)在50 kDa 左右位置有特異性蛋白條帶(圖4)。通過可溶性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白在包涵體中表達。采用不同濃度的尿素溶解，發(fā)現(xiàn)包涵體用8 mol·L－1尿素溶解時，可以獲得大量重組蛋白。

2.5 Rab1A 蛋白多克隆抗體效價測定及其特異性檢測

將純化的pGEX－4T－1－Rab1A重組蛋白分4 次免疫新西蘭大白兔(第二、三、四次免疫分別與第一次間隔12、26 和40 d)，在距離第一次免疫52 d 后，采血收集血清，獲得Rab1A 蛋白的多克隆抗體。對獲得的Rab1A多克隆抗體血清采用ELISA 進行效價測定，結果顯示，多克隆抗體的效價達1 ∶512 000 以上(圖5)。采用Western blot 方法進行抗原檢測，得到一條約50 kDa 的目的條帶，同時也發(fā)現(xiàn)有些小于50 kDa 的非特異性條帶，然而隨著一抗?jié)舛鹊南陆?，非特異條帶也逐漸減少(圖6)。

2.6 微囊藻毒素-LR 對草魚肝臟Rab1A 基因和蛋白表達的影響

分別采用qRT-PCR 和Western blot 檢測Rab1A基因和蛋白的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)Rab1A基因和蛋白的表達在100 μg·kg－1劑量組中顯著被抑制(P<0. 05)，其他劑量組中其表達變化不顯著(P>0. 05) (圖7)。

3 討論

本研究從草魚肝臟組織中克隆得到Rab1A基因cDNA 全長，經(jīng)在線分析可知草魚Rab1A 氨基酸含有1 個Rab 結構域和5 個G box 結構(G1-G5 box)，其中G1 box 是一個磷酸結合環(huán)(P-loop)，G2 box 由蘇氨酸殘基組成，這個區(qū)域與開關Ⅰ區(qū)域重疊，稱為效應區(qū)域[19]。另外，G3 box 與開關Ⅱ區(qū)域重疊[20]。Rab 結構域是Rab 蛋白家族共有的保守區(qū)，G 結構域是GTP結合和水解區(qū)域[21]，分析發(fā)現(xiàn)草魚Rab1A 具有GTP/GDP 和Mg2＋作用位點，這與之前的報道相似[22－23]，表明草魚Rab1A 符合Rab 蛋白家族保守的特征。此外，草魚Rab1A 的C 末端為CC 模式，符合已報道的C 末端的最末幾個氨基酸的幾種模式(C、CC、CXC、CCXX、CXXX 和CCXXX 型)[1]。根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行氨基酸同源性分析，草魚Rab1A與鯉魚等魚類的Rab1A聚為一類，并且與鯉魚等Rab1A的相似性達到了99%。上述結果說明克隆所獲得草魚Rab1A屬于Rab 家族，且Rab1A保守性非常高。

大多數(shù)Rab 蛋白沒有組織特異性，如Rab6A在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的心臟、肝胰腺、腸道、胃、鰓、肌肉和血液等組織中的表達沒有明顯的組織特異性，但在肝胰腺中的表達量比其他組織高[24]；Rab11 在羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)的肝胰腺、肌肉、腸道等組織中的表達量相對較高，在鰓、心臟、胃、血液等組織中少量表達，沒有明顯組織特異性[25]。Zhao 等[14]通過熒光定量檢測分析發(fā)現(xiàn)鯉魚4種Rab1A剪接異構體(Rab1A1、Rab1A2、Rab1A3 和Rab1A4)在腦、皮膚、鰓、血液、腎臟、肌肉、肝臟、脾臟、腸道和心臟中都有表達，其中鯉魚Rab1A3 和Rab1A4在鰓、腎、皮膚、血液和腦中的表達高于肝、脾、腸、心臟和肌肉中的表達，尤其在鰓中的表達量高，而鯉魚Rab1A1 在血液中的表達量最高，鯉魚Rab1A2 在肝臟中的表達量最高。本研究發(fā)現(xiàn)草魚Rab1A在血液、鰓中的表達量相對較高，與鯉魚Rab1A3 的表達方式有一定的相似[14]，這可能與草魚Rab1A和鯉魚Rab1A3的同源關系近有關。今后可進一步研究草魚Rab1A的剪接異構體，了解其不同間接異構體的組織表達特征以及其功能差異等。

草魚Rab1A經(jīng)克隆和重組表達后，獲得重組表達蛋白分子量約為50 kDa (其中載體的分子量為27 kDa)，因此，構建的重組蛋白表達正確，這為后期功能研究奠定了基礎，但本研究制備的多克隆抗體有一些非特異性條帶，隨著一抗?jié)舛鹊南陆?，非特異條帶也逐漸減少甚至消失，這說明制備的抗體的特異性可以滿足試驗需要。囊泡運輸是細胞內物質運輸?shù)闹匾绞?，目前研究發(fā)現(xiàn)，Rab 蛋白作為囊泡運輸?shù)姆肿娱_關，在囊泡的形成、轉運、粘附、錨定和融合等過程中起著重要作用[26－27]。Rab1A除了具有囊泡運輸功能之外，在信號傳導[28]、細胞遷移[29]、自噬調節(jié)[30]以及癌癥的發(fā)生[31]等方面均具有重要作用。此外，Rab 基因在應激反應中也具有潛在作用，如在細菌感染[32]和污染物暴露等情況下[33]。對草魚Rab1A的結構分析結果表明其高度保守，這也說明草魚Rab1A蛋白可能也具有其他物種Rab1A的功能。

近年來，活性氧(reactive oxygen species，ROS)在MC-LR 誘導的細胞凋亡中所起的重要作用已有較多報道[34－35]，Rab 蛋白與ROS 之間的相互作用也引起了人們的關注。Rab 蛋白似乎可以調節(jié)ROS 的產(chǎn)生和消除，有報道表明Rab 蛋白可通過清除ROS，從而在植物的脅迫應答中發(fā)揮作用[36]，同時，ROS 也是GTPases 的上游調節(jié)因子[37]，對Rab 蛋白起到一定的調節(jié)作用。較多證據(jù)表明，MC-LR 可以誘導ROS 的產(chǎn)生并且可通過調節(jié)PP1 和PP2A 的活性來干擾氧化還原平衡從而誘導機體細胞凋亡的產(chǎn)生[38－40]。本研究通過qRT-PCR 以及Western blot 檢測分析發(fā)現(xiàn)MC-LR誘導草魚96 h 后，肝臟中Rab1A基因和蛋白的表達在MC-LR 25 和75 μg·kg－1劑量組變化不顯著(P>0.05)，但在100 μg·kg－1劑量組中的草魚肝臟Rab1A顯著下調(P<0.05)。本研究前期通過TUNEL 等方法發(fā)現(xiàn)100 μg·kg－1劑量的MC-LR 可顯著誘導肝臟細胞凋亡的產(chǎn)生[41]。這說明高劑量的MC-LR 可能通過抑制Rab1A的表達促進ROS 的產(chǎn)生，從而引起細胞凋亡，但這種推測還需要開展Rab1A干擾實驗等進一步驗證。

4 結論

本研究克隆了草魚Rab1A基因，系統(tǒng)分析了其序列特點、組織表達特征，顯示草魚Rab1A基因保守性強且在血液中表達高。制備的多克隆抗體效價高且有較好的特異性，可用于相關的檢測研究。此外，較高劑量的MC-LR 可抑制Rab1A基因和蛋白的表達，提示Rab1A在草魚應對MC-LR 脅迫時參與了反應。本研究為后續(xù)深入探討Rab1A的功能以及在MC-LR 脅迫過程中的作用機制提供了參考。