兩品種獼猴桃果實采后淀粉降解特性比較分析

柴吉釧 劉 璐 陳景丹 王 康 曹士鋒 施麗愉 楊震峰 陳 偉

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315100)

獼猴桃(Actinidia chinesis)是典型的呼吸躍變型果實，躍變一旦發(fā)生，其果肉硬度、顏色、細(xì)胞壁、營養(yǎng)物質(zhì)和芳香物質(zhì)均會發(fā)生明顯變化[1]。商業(yè)上獼猴桃主要有中華獼猴桃(A. chinensis)和美味獼猴桃(A.deliciosa)2 個品種[2]。不同品種的獼猴桃之間存在差異[3]，中華獼猴桃包括Hort 16A、Sanuki Gold、Kohi 等，該品種獼猴桃果肉呈黃色，果實可溶性固形物含量高、有機(jī)酸濃度低[4]；而美味獼猴桃Hayward 果實體積大、果肉呈綠色。兩品種獼猴桃中，中華獼猴桃更易產(chǎn)生乙烯[5]，即中華獼猴桃果實的貯藏期和貨架期均短于美味獼猴桃[6]。

獼猴桃果實在成熟過程中碳水化合物含量的增加主要歸因于淀粉的累積。而果實是植物貯藏淀粉的重要器官之一，未成熟的香蕉、獼猴桃、蘋果等果實中均含有大量淀粉[7－8]。Richardson 等[9]將獼猴桃果實成熟發(fā)育過程分為細(xì)胞分裂期、淀粉積累期和果實成熟期3 個階段。果實在細(xì)胞分裂期結(jié)束后開始積累淀粉，進(jìn)入成熟期后淀粉開始降解，直至果實完全成熟，淀粉幾乎完全轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄蕴荹9]。王貴禧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采后獼猴桃果實的快速軟化主要是由于淀粉酶活性的上升加快了淀粉的降解速度。

淀粉降解由多種酶共同作用完成，起始于淀粉粒表面發(fā)生的可逆葡聚糖磷酸化[11－12]。淀粉粒在葡聚糖水合雙激酶(glucan water dikinase，GWD)和磷酸化葡聚糖水合雙激酶(phosphoglucan water dikinase，PWD)的作用下磷酸化[13]，使淀粉粒結(jié)構(gòu)松散，有利于水解酶分解糖鏈，但水解酶不能隔著磷酸基團(tuán)降解糖苷鍵，因此需要去磷酸酶( phosphoglucan phosphatase)釋放磷酸[14－15]，使水解酶徹底降解糖鏈，同時形成一個磷酸循環(huán)[16]。擬南芥中存在2 種去分支 酶(dranching enzyme，DBE)，包括異淀粉酶(isoamylase，ISA) 和極限糊精酶(limit dextrinase，LDA)，它們都是支鏈淀粉徹底降解所必需的酶[17]。松散淀粉粒在ISA3 的作用下生成可溶性線性葡聚糖，再在β－淀粉酶(β-amylase，BAM)的催化下水解生成殘缺的麥芽三糖和麥芽糖[14，17－18]，也可以在葡聚糖磷酸化酶(α-glucanglucan phospholylase，PHS)和歧化酶(disproportionating enzyme，DPE)作用下進(jìn)一步形成葡萄糖－1－磷酸和葡萄糖。相比于BAM，α－淀粉酶(αamylase，AMY)對于暫時的淀粉降解作用并不顯著，但AMY3 可獨立于GWD 和PWD，直接作用于非水溶性淀粉粒，可將淀粉內(nèi)部的α－1，4 共價鍵進(jìn)行切割，釋放出的分支葡聚糖在ISA3 和(或)LDA 的作用下通過脫支反應(yīng)得到線性葡聚糖，使得淀粉粒的降解變得相對簡單[19]。

目前果實淀粉降解相關(guān)酶基因的研究只有在番茄、香蕉、獼猴桃等水果中有少量報道[20]，且尚未建立明確的遺傳背景。為此，本試驗以紅陽和翠玉獼猴桃果實為試驗材料，探討不同品種獼猴桃果實成熟軟化與淀粉降解的關(guān)系，研究其內(nèi)在的聯(lián)系，以期為淀粉降解與成熟軟化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

獼猴桃果實采自浙江省寧波市東錢湖獼猴桃種植基地，分別摘取形狀勻稱、大小均一、處于商業(yè)成熟(可溶性固形物含量為5.5%～6.0%，硬度為35～40 N)且未受病蟲害的紅陽(HY)和翠玉(CY)2 個品種獼猴桃果實，在果實采摘后1 h 內(nèi)運至實驗室。隨機(jī)將獼猴桃果實分為3 組，每組至少60 個，試驗重復(fù)3次。隨后置于恒溫恒濕箱(溫度25℃，濕度95%)中貯存12 d，每2 d 進(jìn)行1 次取樣。果實去皮后，去頭去尾，沿頭尾方向切開，選用與切開面中心對稱的果肉，快速放入液氮，待其完全凍結(jié)后，快速磨成粉，混合均勻后裝入離心管，存放于－80℃超低溫冰箱中備用。

RNA 提取試劑盒、DNaseI，美國Omega Bio-Tek 公司；SuperRT cDNA 第一鏈合成試劑盒，江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TMS-Touch 物性分析儀，美國FTC 公司；2014C 型氣相色譜儀，日本島津；NanoDro-p2000 核酸蛋白分析儀，美國Thermo Fisher Scientific；凝膠成像儀，美國BIO-RAD；JEOL JFC－1600 離子濺射儀、JEOL JSM－6460 LV 掃描電鏡，日本JEOL。

1.3 試驗方法

1.3.1 果實硬度 結(jié)合質(zhì)地剖面分析法(texture profde analysis，TPA)通過TMS-Touch 物性分析儀對獼猴桃果肉進(jìn)行硬度測試。測試參數(shù)設(shè)置如下:測試速度30 mm·min－1，果肉受壓變性15%，觸發(fā)力0.1 N(傳感器量程為25 N 時)或1 N(傳感器量程為1 000 N時)。試驗選用直徑為7.5 mm 的圓柱形探頭。每次隨機(jī)選取5 個果實，沿赤道部位進(jìn)行2 次硬度測定。

1.3.2 乙烯釋放速率測定 選擇2.5 L 的密閉容器作為乙烯釋放速率測定專用容器。從貯藏樣品中隨機(jī)選擇5 個果實放入專用容器中，迅速蓋緊盒蓋，同時放入原貯藏環(huán)境中，2 h 以后運用氣相色譜儀對容器中的乙烯釋放量進(jìn)行測定，測定過程以標(biāo)準(zhǔn)乙烯氣體作為對照，計算桃果實乙烯釋放速率，結(jié)果以μL·kg－1·h－1FW 表示。本試驗選用Rtx－5MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm)色譜柱，選用高純度N2作為載氣，其他相關(guān)測定參數(shù)為:柱溫80℃，檢測器(FID)溫度270℃，進(jìn)樣口溫度230℃，進(jìn)樣量1 mL。

1.3.3 淀粉粒提取及掃描電鏡觀察 參考聶丹[21]的方法提取獼猴桃外果肉和果心淀粉。稱取液氮研磨后的果肉25 g，放置于100 mL 1 g·mL－1的亞硫酸氫鈉溶液中浸泡過夜。次日使用100 目標(biāo)準(zhǔn)篩過濾漿液，將過濾所得淀粉懸濁液4 000 r·min－1離心20 min，沉淀即為淀粉沉淀。使用超純水再次清洗淀粉沉淀，離心(4 000 r·min－1，20 min)取沉淀，重復(fù)3 次，獲得純度更高的淀粉沉淀。將所獲得的淀粉沉淀倒入氫氧化鈉溶液(0.002 g·mL－1)中混勻，靜置4 h。靜置完成后，離心(4 000 r·min－1，20 min)取沉淀即為淀粉。將獲得的淀粉放入去離子水中繼續(xù)清洗，離心去沉淀，重復(fù)3次，而后將所獲得的淀粉放入無水乙醇中繼續(xù)清洗，直至無色，然后用去離子水清洗沉淀直到無乙醇?xì)馕丁Ｗ詈笫褂?00 目標(biāo)準(zhǔn)篩過濾懸濁液，離心(4 000 r·min－1、 20 min)棄上清液取沉淀，置于烘箱中，45℃烘干過夜。

金屬鍍膜:參考蕭允藝[20]的金屬鍍膜法，即采用特殊裝置JEOL JFC－1600 離子濺射儀將電阻率小的鉑金粉蒸發(fā)后覆蓋在樣品表面。樣品表面鍍上一層金屬膜可以有效抵御電子束的傷害，使二次電子產(chǎn)生率顯著增加，所獲得的圖像質(zhì)量更佳，同時充電、放電效應(yīng)也得到有效抑制。

掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察:參數(shù)為20 kV，真空條件下，放大倍數(shù)分別為2 000倍、5 000 倍和10 000 倍。

1.3.4 淀粉含量測定 參考苗紅霞等[22]的方法。將2 g 的果肉樣品放入5 mL 80%乙醇中，并用勻漿機(jī)混勻，離心(4 000×g，15 min)取沉淀，接著倒入5 mL 去離子水充分清洗，再次離心(4 000×g，15 min)取沉淀，將沉淀放入5 mL 80% Ca(NO3)2溶液中繼續(xù)溶解，然后通過沸水浴加熱溶液10 min，離心(4 000×g，4 min)取沉淀，所獲取的沉淀通過80% Ca(NO3)2溶液提取2 次。然后將上清液混合并定容至20 mL。在100 μL 0.01 mol·L－1I2-KI 溶液中加入2 mL 上清液混勻，測定600 nm 波長處的吸光度值，重復(fù)3 次。用淀粉標(biāo)準(zhǔn)液制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品獼猴桃果實的淀粉含量(標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制使用淀粉標(biāo)準(zhǔn)液)，淀粉含量結(jié)果以mg·g－1FW 表示。

1.3.5 獼猴桃果實RNA 的提取及cDNA 的合成 參考邵佳蓉等[23]的方法，略有調(diào)整。兩品種獼猴桃果實的總RNA 提取使用植物RNA 提取試劑盒，具體過程參照說明書。試驗過程中加入DNaseI 從而排除總RNA 中可能的微量DNA 污染，防止對后續(xù)cDNA 合成過程造成影響。使用核酸蛋白分析儀對樣品RNA 濃度和純度進(jìn)行測定。通過凝膠成像儀觀察提取RNA條帶的完整性、大小和清晰度。按照SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行cDNA 合成。

1.3.6 實時熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測 本試驗?zāi)０鍨閺墨J猴桃基因組數(shù)據(jù)庫中(http:/ /bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)獲得的各基因全長序列，相關(guān)引物通過Primer 6 軟件設(shè)計，引物如表1 所示。qRT-PCR 利用熒光定量引物進(jìn)行3 步法擴(kuò)增。qRT-PCR 程序:95℃預(yù)變性7 min；95℃變性15 s，45℃退火30 s，75℃延伸15 s，39 個循環(huán)。內(nèi)參引物為Actin基因(引物見表1，退火溫度為63℃)，設(shè)置陰性對照。采用2－ΔΔCT方法對最終的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

表1 試驗所需引物Table 1 Primers required for the experiment

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5 軟件繪圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用非配對T 檢驗進(jìn)行顯著性分析，采用Pearson 進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃果實采后硬度的變化

由圖1 可知，果實的硬度是指果肉抗壓能力的強弱，可直觀地反映出果實的成熟軟化。兩品種獼猴桃果實在成熟過程中硬度均呈下降趨勢，在貯藏后期(4～12 d)CY 獼猴桃果實的硬度極顯著高于HY 果實。

2.2 獼猴桃果實采后乙烯釋放速率的變化

由圖2 可知，在果實貯藏過程中，CY 獼猴桃果實的乙烯釋放速率保持在較低的水平，基本沒有乙烯釋放。HY 獼猴桃果實在貯藏前期與CY 果實無顯著性差異，貯藏10 d 時其乙烯釋放量急劇增加，且極顯著高于CY 果實(P<0.001)。

2.3 獼猴桃果實采后淀粉形態(tài)變化

由圖3 可知，在剛采摘的獼猴桃果肉中，淀粉粒表面光滑，在果實成熟軟化過程中，兩品種獼猴桃果實的淀粉顆粒均有不同程度的消化和破碎，這是淀粉降解的痕跡，且CY 獼猴桃果實的淀粉降解緩于HY 果實。

2.4 獼猴桃果實采后淀粉含量的變化

由圖4 可知，在獼猴桃果實貯藏期間，其外果肉和果心的淀粉含量均呈下降趨勢，HY 獼猴桃外果肉中淀粉含量在貯藏前期(0～2 d)極顯著高于CY 外果肉(P<0.01)，但在貯藏后期(8～12 d)極顯著低于CY 外果肉(P<0.001)；HY 獼猴桃果心中淀粉含量在貯藏2～4 d 與CY 果實無顯著差異，但在貯藏后期(6～12 d)極顯著低于CY 果心(P<0.001)。表明HY 獼猴桃果實淀粉含量下降速率快于CY 獼猴桃果實。

2.5 獼猴桃果實采后淀粉降解酶基因表達(dá)變化

由圖5 可知，在整個獼猴桃果實貯藏期間，獼猴桃外果肉中AcGWD、AcPWD和AcLSF1 的表達(dá)量呈下降趨勢，且CY 獼猴桃外果肉和果心中AcGWD的相對表達(dá)量均極顯著高于HY 獼猴桃(P<0.001)；在AcPWD表達(dá)量下降過程(4～12 d)中，除貯藏10 d 時CY 獼猴桃外果肉和果心的相對表達(dá)量極顯著高于HY 獼猴桃(P<0.01)，其他貯藏時間兩品種獼猴桃無顯著差異；貯藏前期AcLSF1 的相對表達(dá)量表現(xiàn)為HY 獼猴桃外果肉(0～4 d)和果心(0 d)顯著或極顯著高于CY 獼猴桃；0 d 時AcLSF1 在HY 獼猴桃果心中的表達(dá)極顯著高于CY 獼猴桃(P<0.01)。兩品種獼猴桃果心中AcGWD、AcPWD和AcLSF1 的表達(dá)趨勢與果肉基本一致。

由圖6 可知，CY 獼猴桃外果肉AcISA3 的相對表達(dá)量在貯藏10～12 d 時顯著高于HY 果實(P<0.01)；果心中的AcISA3 表達(dá)量在貯藏前期(0～6 d)略有上升，后期(10～12 d)急劇下降。貯藏期間，外果肉中AcLDA1 的相對表達(dá)量呈先上升后略下降的趨勢，在貯藏前期(2～6 d)HY 獼猴桃中的表達(dá)量極顯著高于CY獼猴桃，在貯藏后期(8～12 d)無顯著差異；在果心中，AcLDA1 的相對表達(dá)量與外果肉存在差異，且在貯藏前期(2～6 d)CY 獼猴桃的AcLDA1 相對表達(dá)量顯著或極顯著高于HY 獼猴桃。

由圖7 可知，兩品種獼猴桃外果肉中AcAMY1 相對表達(dá)量在貯藏前期呈上升的趨勢之后呈波動變化，HY 獼猴桃中AcAMY1 的相對表達(dá)量達(dá)到峰值早于CY獼猴桃；且在果心的變化趨勢與外果肉相似，但CY 獼猴桃在貯藏4～12 d 過程中果心AcAMY1 的相對表達(dá)量極顯著高于HY 獼猴桃。AcAMY3 的相對表達(dá)量在貯藏2～8 d 時先急劇下降后又上升，且在不同品種呈相同趨勢。

由圖8 可知，獼猴桃外果肉與果心中AcBAM1 的相對表達(dá)量在貯藏0～2 d 時迅速增加，貯藏后期(6～12 d)緩慢上升，且貯藏10～12 d 時HY 獼猴桃外果肉和果心的相對表達(dá)量顯著或極顯著高于CY 獼猴桃。貯藏期間，兩品種獼猴桃外果肉和果心AcBAM3 的相對表達(dá)量呈上升趨勢，且與乙烯釋放趨勢一致，貯藏后期(8～12 d)基因相對表達(dá)量急劇增加，且HY 獼猴桃外果肉AcBAM3 的相對表達(dá)量極顯著高于CY 外果肉，兩品種獼猴桃果心中AcBAM3 的表達(dá)與外果肉結(jié)果基本一致。

由圖9 可知，在貯藏期間，兩品種獼猴桃外果肉中AcDPE1 和AcDPE2 的相對表達(dá)量在貯藏2 d 時上升隨后下降，后期又呈上升趨勢，且HY 獼猴桃外果肉表達(dá)量均顯著或極顯著高于CY 獼猴桃；果心中AcDPE1 和AcDPE2 表達(dá)量隨貯藏時間總體呈上升趨勢，但兩品種間均無顯著差異(P>0.05)。果心和外果肉中AcPHS1的相對表達(dá)量均隨著貯藏時間的延長呈下降趨勢，貯藏前期(2～4 d)HY 獼猴桃外果肉中AcPHS1 的相對表達(dá)量極顯著高于CY 獼猴桃，而在貯藏后期(10～12 d)極顯著低于CY 外果肉。

3 討論

已有研究表明，不同品種(或品系)獼猴桃采收期和采后生理變化(尤其是采后果實的呼吸作用、乙烯代謝及果實軟化等生理變化)與果實耐貯性和貯藏品質(zhì)密切相關(guān)[24－26]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時間的延長，兩品種獼猴挑果實的硬度及淀粉含量均呈下降趨勢，硬度的變化與淀粉含量變化較一致；同時在乙烯發(fā)生躍變時，淀粉含量快速下降，HY 獼猴桃果實淀粉含量的下降速率快于CY 果實，且果心中淀粉含量的下降速率慢于外果肉；HY 果實釋放乙烯速率急劇上升時，CY 果實一直保持在低水平。這表明HY 獼猴桃果實出現(xiàn)呼吸躍變早于CY 果實。

果實成熟過程中產(chǎn)生大量內(nèi)源乙烯。內(nèi)源乙烯對果實多糖水解、香味物質(zhì)產(chǎn)生、硬度下降等一系列生理變化具有調(diào)控作用[27]。乙烯是果實尤其是躍變型果實成熟衰老進(jìn)程中的關(guān)鍵因子。乙烯釋放量可以反映獼猴桃果實的成熟衰老進(jìn)程。已有研究報道，在桃果實貯藏期間，當(dāng)果實硬度快速下降時，果實內(nèi)源乙烯含量出現(xiàn)躍變高峰[28]。黃森等[29]研究發(fā)現(xiàn)，柿子內(nèi)源乙烯與果實硬度呈顯著相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HY 獼猴桃果實硬度迅速下降并伴隨乙烯躍變，而CY 獼猴桃果實硬度緩慢下降未出現(xiàn)乙烯釋放高峰。HY 果實中乙烯的釋放與硬度呈顯著負(fù)相關(guān)(r＝－0.898，P<0.01)。

成熟前，果實內(nèi)大量的淀粉是果肉保持硬度的重要因素。淀粉對細(xì)胞起支撐作用，可維持組織整體膨壓，因此，果實采后成熟軟化與淀粉的降解有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在蘋果果實發(fā)育過程中，β－淀粉酶和α－淀粉酶活性由低到高，與淀粉含量呈現(xiàn)互為消長的變化，推測它們參與了果實質(zhì)體中淀粉的降解[30]。魏建梅等[31]對香蕉的研究發(fā)現(xiàn)，MAmy、Maisa、Ma-bmy等基因參與采后淀粉降解；也有研究發(fā)現(xiàn)，β－淀粉酶活性的明顯增強在香蕉果實淀粉降解中起關(guān)鍵作用[32－33]。本研究發(fā)現(xiàn)，在兩個品種獼猴桃中，AcAMY1 和AcAMY3 表達(dá)量在淀粉降解前期增加，表明AcAMY1 和AcAMY3 在淀粉降解前期起作用。Hu 等[34]研究表明，獼猴桃AdBAM3.1/3L/9 與淀粉降解呈顯著正相關(guān)，證實該基因可能參與淀粉降解過程。也有研究發(fā)現(xiàn)在獼猴桃葉片中穩(wěn)定過表達(dá)AdBAM3L能有效降低葉片淀粉含量，說明該基因可能是獼猴桃淀粉降解的關(guān)鍵酶基因[35]。本研究中，AcBAM1 和AcBAM3 基因的相對表達(dá)量隨著淀粉降解在貯藏后期呈上升趨勢，且在HY 獼猴桃外果肉中的表達(dá)均比CY 高，尤其AcBAM3 相對變達(dá)量明顯增強，說明AcBAM1 和AcBAM3 基因在HY 獼猴桃果實的淀粉降解過程中發(fā)揮了重要作用，且AcBAM3 基因的作用更為關(guān)鍵。已有研究表明，DPE 涉及了淀粉代謝相關(guān)酶的磷酸化過程。本研究中，AcDPE1 和AcDPE2 在HY 獼猴桃外果肉中的相對表達(dá)量均顯著或極顯著高于CY，表明AcDPE1 和AcDPE2 基因是HY獼猴桃果實淀粉降解的關(guān)鍵基因。這與陳景丹等[36]的研究結(jié)果一致。Xiao 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，MaPHS基因參與了香蕉果實的淀粉降解。PHS 活性主要受該基因表達(dá)水平的影響，該酶在淀粉代謝過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，貯藏前期HY 果實AcPHS1 基因表達(dá)量總體高于CY 果實，這可能導(dǎo)致HY 淀粉降解速度更快。植物中淀粉磷酸化是可逆的，由兩種類型的磷酸化酶催化，分別是葡聚糖水合雙激酶(添加磷酸基)和磷酸葡聚糖磷酸酶(去除磷酸基團(tuán))，并且這2 種酶可以促進(jìn)或維持葡聚糖水解[38]。本研究還發(fā)現(xiàn)隨著淀粉降解，AcGWD、AcPWD、AcLSF1 在貯藏期間2 個品種獼猴桃外果肉和果心中的表達(dá)量均呈下降趨勢，可能與淀粉含量有關(guān)。另外，本試驗中AcDPE1、AcDPE2、AcGWD、AcPWD和AcLSF1 基因的相對表達(dá)量隨貯藏時間變化的結(jié)果，與香蕉[37]中的結(jié)果相反，這可能是不同品種果實淀粉代謝存在差異所導(dǎo)致的。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，HY 獼猴桃果實成熟軟化快于CY 果實。隨著貯藏期的延長，HY 獼猴桃果實硬度迅速下降并伴隨出現(xiàn)乙烯躍變，CY 果實硬度緩慢下降且未出現(xiàn)乙烯釋放高峰。在兩品種獼猴桃中，AcAMY1 和AcAMY3 在淀粉降解前期起作用，AcBAM1、AcBAM3、AcDPE1 和AcDPE2 在淀粉降解中可能起重要作用，尤其是AcBAM3 可能起關(guān)鍵作用。另外，AcBAM1、AcBAM3、AcDPE1、AcDPE2、AcPHS1 基因相對表達(dá)量在HY 獼猴桃果實中總體均比CY 果實中高，這可能導(dǎo)致了HY 淀粉降解速度更快。貯藏期間兩品種獼猴桃果實AcGWD、AcPWD、AcLSF1 的相對表達(dá)量隨著淀粉降解呈下降趨勢，可能與淀粉含量有關(guān)。