我國有機(jī)茶穩(wěn)定同位素特征與δ15N標(biāo)識相關(guān)性研究

李春霖 汪秋紅 聶 晶 周燕君 邵圣枝 袁玉偉 傅尚文 王 鈁

(1浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點實驗室，浙江 杭州 310021)

我國有機(jī)茶產(chǎn)業(yè)特色鮮明，發(fā)展迅速。2015年至2018年我國有機(jī)茶生產(chǎn)面積由4.4 萬公頃增長至11.1 萬公頃，增幅達(dá)152%[1]。2018年我國有機(jī)茶產(chǎn)量為19.3 萬噸，占我國茶葉總產(chǎn)量的7.4%[2]。我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 5196－2002[2]規(guī)定，有機(jī)茶在生產(chǎn)過程中不得使用農(nóng)藥和化肥等化學(xué)合成物質(zhì)。由于有機(jī)茶的生產(chǎn)及認(rèn)證成本較高，其市場售價通常高于常規(guī)生產(chǎn)的成品茶，有機(jī)茶仿冒問題時有發(fā)生，因此有機(jī)茶產(chǎn)品的監(jiān)管與鑒定工作十分重要。目前有機(jī)茶認(rèn)證檢測主要集中于農(nóng)藥殘留和重金屬等安全指標(biāo)，尚無有效的檢測方法對施肥種類進(jìn)行判別。

植物穩(wěn)定同位素比率(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O)能反映植物生長過程中的環(huán)境因素差異，已在農(nóng)產(chǎn)品的真實性鑒別和生產(chǎn)方式鑒別中有一定的應(yīng)用研究[3－4]。已有研究表明δ15N 可以作為區(qū)分常規(guī)種植和有機(jī)種植產(chǎn)品的重要指標(biāo)之一[5]。有機(jī)肥中15N 通過氨揮發(fā)、反硝化等化學(xué)反應(yīng)發(fā)生明顯富集[6]，對生長中作物的δ15N 產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)在蔬菜[7]、大米[8－9]、小麥[10]、葡萄酒[11]和橄欖油[12]等農(nóng)產(chǎn)品中，有機(jī)產(chǎn)品的δ15N 通常高于常規(guī)產(chǎn)品。關(guān)于有機(jī)茶δ15N 標(biāo)識的相關(guān)研究較少，已有學(xué)者測得日本有機(jī)茶和常規(guī)茶的δ15N 分別為6.8‰和4.2‰，具有顯著差異[13]。另有研究表明，茶葉中δ15N 與有機(jī)栽培時間有關(guān)[14]。同時，有機(jī)栽培會影響植物的光合作用、呼吸作用以及蒸騰作用等[15－16]，這些生理代謝活動會造成植物碳、氫、氧同位素發(fā)生分餾。碳同位素比率(δ13C)主要取決于植物光合作用類型和速率，與環(huán)境中光照、溫度、CO2等因素有關(guān)[17]。植物有機(jī)物中氧同位素比率(δ18O)則與CO2等光合作用參數(shù)以及降水等因素有關(guān)[18]。氫同位素比率(δ2H)與降雨、濕度、氣孔開合等密切相關(guān)[19]。現(xiàn)有報道表明利用穩(wěn)定同位素技術(shù)可以開展有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品的真實性鑒別[20]，在有機(jī)茶鑒別方面具有可行性。

目前我國有機(jī)茶中穩(wěn)定同位素特征分布情況尚不清楚，δ15N 作為有機(jī)鑒別標(biāo)識的影響因素有待進(jìn)一步研究。本研究首次廣泛收集全國范圍內(nèi)有機(jī)茶認(rèn)證企業(yè)的樣品，分析穩(wěn)定同位素特征(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O)，探究標(biāo)識特征δ15N 的變化規(guī)律及其主要影響因素，旨在為有機(jī)茶認(rèn)證的市場監(jiān)管和消費者權(quán)益保障提供技術(shù)支撐與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗材料為145 個有機(jī)茶樣品，來自全國13 個省，涉及39 個地市及自治州，由全國102 家有機(jī)茶認(rèn)證企業(yè)提供，均為在售成品茶。樣品詳細(xì)來源信息見表1。其中2018年各省份有機(jī)茶生產(chǎn)面積數(shù)據(jù)來源于國家市場監(jiān)督管理總局[1]。

表1 有機(jī)茶樣品來源信息表Table 1 Information of the organic tea samples

穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，IAEA-CH － 6 (蔗糖，δ13CV-PDB＝－10.45‰ ± 0.03‰)、IAEA-N－2(硫酸銨，δ15Nair＝20.30‰ ± 0.20‰)，購于國際原子能機(jī)構(gòu)(IAEA，奧地利)；B2155(酪蛋白，δ13CV-PDB＝－26.98‰± 0.13‰，δ15Nair＝5.94‰ ± 0.08‰)，購于英國Elemental Microanalysis 公 司； USGS64 (甘氨酸，δ13CV-PDB＝－40.81‰ ± 0.04‰)、USGS40(δ15Nair＝－4.52‰ ± 0.06‰)、USGS54(加拿大松，δ2HV-SMOW＝－150.4‰ ± 1.1‰，δ18OV-SMOW＝17.79‰ ± 0.15‰)、USGS55(墨西哥木，δ2HV-SMOW＝－28.2‰ ± 1.7‰，δ18OV-SMOW＝19.12‰ ± 0.07‰)、USGS56(南非紅象牙木，δ2HV-SMOW＝－44.0‰ ± 1.8‰，δ18OV-SMOW＝27.23‰± 0.03‰)，購于美國地質(zhì)勘探局Reston 同位素實驗室。

1.2 儀器與設(shè)備

Vario PYRO cube、Vario Isotope cube 型元素分析儀、Isoprime 100 型、Biovision 穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀，德國Elementar 公司；XP6 型天平，瑞士Mettler-Toledo公司；HR2864 粉碎機(jī)，飛利浦電子公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理 所有樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過80目篩(孔徑0.180 mm)，常溫避光保存。

1.3.2 碳、氮元素及其穩(wěn)定同位素檢測 每個樣品稱取粉末3.0 ～ 4.0 mg 包樣于錫箔杯中，經(jīng)自動進(jìn)樣器進(jìn)入元素分析儀。樣品中的碳和氮元素經(jīng)燃燒后分別轉(zhuǎn)化為純凈的CO2和N2氣體，進(jìn)入同位素比率質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。元素分析儀的燃燒管主要填料為WO3，溫度1 150℃，還原管填料為Cu，溫度850℃，載氣為高純氦氣(純度>99.999%)。

1.3.3 氫、氧穩(wěn)定同位素檢測 每個樣品稱取粉末0.8 ～ 1.2 mg 包樣于銀舟中，經(jīng)自動進(jìn)樣器進(jìn)入元素分析儀。樣品中的氫元素和氧元素經(jīng)高溫裂解后分別轉(zhuǎn)化為H2和CO，進(jìn)入同位素比率質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。元素分析儀裂解爐溫度為1 450℃，氦氣吹掃流量為150 mL·min－1。

1.3.4 穩(wěn)定同位素比率計算 根據(jù)公式計算各穩(wěn)定同位素比率[21]:

δE ＝(R樣品－R標(biāo)準(zhǔn))/R標(biāo)準(zhǔn)×1 000‰

式中，E 代表元素C、N、H、O；R樣品為檢測樣品中重同位素與輕同位素豐度之比，即13C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O；R標(biāo)準(zhǔn)為國際標(biāo)準(zhǔn)品中重同位素與輕同位素豐度比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有樣品檢測均重復(fù)2 次，取平均值作為該樣品的元素含量及穩(wěn)定同位素比率。不同產(chǎn)地樣品間的δ15N 差異分析采用單因素方差分析中的Duncan 法進(jìn)行比較，不同生產(chǎn)面積地區(qū)樣品間的δ15N 差異分析采用非參數(shù)檢驗中的Kruskal Wallis 檢驗方法進(jìn)行。通過正態(tài)分布模型模擬δ15N 分布情況，樣品δ2H 和δ18O進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)處理均采用IBM SPSS Statistics 21(美國IBM 公司)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 我國有機(jī)茶穩(wěn)定同位素特征

本研究對我國三分之二產(chǎn)茶省份的145 個有機(jī)茶樣品開展了穩(wěn)定同位素分布情況調(diào)查，包括江南、江北、華南和西南四大茶區(qū)，覆蓋范圍廣，代表性強(qiáng)。由表2 可知，C 元素含量介于36.7% ～ 47.5%之間，平均值為42.2%，其中云南省樣品平均值最低，陜西省最高，各產(chǎn)地間C 元素含量無顯著差異。N 元素含量為1.8% ～ 6.2%，平均值為4.9%。河南省有機(jī)茶樣品的N 元素含量最高，其次為陜西、江蘇、安徽、四川和浙江，廣東省有機(jī)茶樣品N 元素含量最低，顯著低于上述省份，南方省份樣品N 元素含量普遍低于北方省份。C 和N 是植物體內(nèi)兩種重要的元素，含C 和N的化合物對茶樹生長和茶葉品質(zhì)均起著至關(guān)重要的作用。地理因素、氣候因素、品種及栽培方式均會影響茶樹的碳氮代謝平衡[22]。

表2 有機(jī)茶C、N 元素含量Table 2 Concentrations of C and N in organic tea samples /%

有機(jī)茶樣品中穩(wěn)定同位素比率見表3，不同產(chǎn)地的δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 存在一定的區(qū)域差異。δ13C值介于－31.0‰ ～ －23.7‰之間，平均值為－26.6‰，湖南省有機(jī)茶樣品的平均值最低，云南省最高，各產(chǎn)地間無顯著差異。已有研究表明，δ13C 分布差異主要受植物光合作用的影響，包括溫度、光照強(qiáng)度、CO2濃度等光合參數(shù)[23]。δ15N 值范圍為－5.2‰ ～ 6.6‰，平均值為1.1‰，各省份有機(jī)茶樣品的δ15N 標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，不同產(chǎn)地間存在差異。其中江西省和貴州省有機(jī)茶樣品δ15N 值最高，河南省樣品δ15N 值最低。δ2H 值范圍為－107.1‰ ～ －24.8‰，平均值為－49.4‰，其中陜西有機(jī)茶樣品δ2H 值最高，福建樣品最低，各省份有機(jī)茶樣品δ2H 的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大。δ18O值介于17.2‰ ～32.0‰之間，平均值為26.9‰，與δ2H 值在不同產(chǎn)地的分布規(guī)律相似，江蘇省有機(jī)茶樣品最高，福建最低。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，δ2H 值與δ18O 值在0.01 水平上呈顯著正相關(guān)(r＝0.74，P<0.01)。

2.2 有機(jī)茶δ15N 特征正態(tài)分布模型

δ15N 能夠在一定程度上反映作物的栽培方式。已有研究表明施用有機(jī)肥料與化學(xué)肥料的大米、蔬菜等作物的δ15N 值差異明顯[7－12]。δ15N 作為有機(jī)產(chǎn)品的重要指標(biāo)需要開展進(jìn)一步分析。本研究所涉及的145 個有機(jī)茶δ15N 頻率直方圖和正態(tài)分布曲線如圖1-A 所示。在樣品的頻率分布中，41 個樣品的δ15N<0，占全部樣品的28%；74 個樣品的δ15N 介于0 ～3.0‰之間，占比51%；30 個樣品的δ15N > 3.0‰，占比21%。通過建立145 個樣品的正態(tài)分布模型，模擬我國有機(jī)茶中δ15N 的分布情況。在正態(tài)分布模型中，有機(jī)茶的δ15N 平均值(μ)為1.2‰，中位數(shù)為1.1‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)為2.3‰。95%的樣品δ15N 分布在－3.2‰～ 5.6‰(μ ± 1.96σ)范圍內(nèi)，99%的樣品δ15N 分布在－4.6‰ ～ 7.0‰(μ ± 2.58σ)范圍內(nèi)。

不同省份樣品的δ15N 頻率分布情況如圖1-B 所示。結(jié)合各產(chǎn)地的δ15N 平均值，平均值最高的江西省有75%的樣品δ15N > 3.0‰，在各省份中占比最大，所有樣品的δ15N 均大于0。其次貴州有25%的樣品δ15N> 3.0‰，δ15N 也全部大于0。福建和浙江δ15N >3.0‰的樣品占比較大，分別為40%和34%。云南和廣東的樣品數(shù)量較少，其δ15N 均介于0 ～ 3.0‰之間。湖北和湖南的分布情況相似，60%的樣品δ15N 介于0～ 3.0‰之間，δ15N > 3.0‰的樣品分別占比16%和10%。δ15N 平均值較低的5 個省份陜西、四川、江蘇、安徽和河南，δ15N<0 的樣品分別占比33%、72%、75%、40%和67%，其中陜西、江蘇、安徽和河南沒有樣品δ15N 大于3.0‰。

2.3 有機(jī)茶δ15N 特征與生產(chǎn)面積相關(guān)性

各產(chǎn)地有機(jī)茶δ15N 分布差異與茶樹是否處于轉(zhuǎn)換期密切相關(guān)。國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 5197－2002有機(jī)茶生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》[24]規(guī)定，常規(guī)茶園成為有機(jī)茶園一般需要經(jīng)過3年的轉(zhuǎn)換期，生產(chǎn)者在轉(zhuǎn)換期間必須完全按有機(jī)茶生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程的要求進(jìn)行管理，但品質(zhì)特征可能受到前期肥料、栽培等因素的影響。2018年全國已渡過轉(zhuǎn)換期的有機(jī)茶產(chǎn)量為11.6 萬噸，轉(zhuǎn)換期產(chǎn)品產(chǎn)量為7.7 萬噸(圖2-A)，說明我國有機(jī)茶中有近40%屬于轉(zhuǎn)換期產(chǎn)品。目前我國共有21 個省份生產(chǎn)有機(jī)茶，圖2-B 為2016年至2018年我國有機(jī)茶生產(chǎn)面積連續(xù)排名前九位的省份[1]。連續(xù)3年生產(chǎn)面積大的省份，表明已渡過轉(zhuǎn)換期的有機(jī)茶產(chǎn)量多，而生產(chǎn)面積小的省份，推測部分產(chǎn)品尚處于轉(zhuǎn)換期。將本研究所涉及的省份按照生產(chǎn)面積進(jìn)行合并與分組，云南、江西和貴州為生產(chǎn)面積大的地區(qū)，江蘇、河南和陜西為生產(chǎn)面積小的地區(qū)，兩組均為10 個樣品。對兩組樣品進(jìn)行δ15N 值比對，結(jié)果如圖3-A 所示。兩組樣品的δ15N 分布較為集中，分別分布于1.6‰ ～ 5.8‰和－2.5‰ ～ 0.4‰之間，平均值分別為3.2‰和－0.6‰。采用非參數(shù)檢驗對兩組樣品進(jìn)行比較，生產(chǎn)面積大的地區(qū)樣品δ15N 顯著高于生產(chǎn)面積小的地區(qū)樣品(P<0.01)。將兩組樣品的δ15N 值分別建立正態(tài)分布曲線，結(jié)果見圖3-B。生產(chǎn)面積大的地區(qū)95%的樣品δ15N 分布范圍是0.5‰ ～ 5.9‰，生產(chǎn)面積小的地區(qū)95%的樣品δ15N 分布范圍為－2.6‰ ～ 1.4‰。兩組樣品在0.5‰ ～ 1.4‰之間有部分重合。

3 討論

目前關(guān)于有機(jī)茶穩(wěn)定同位素的相關(guān)研究較少，建立覆蓋面廣、穩(wěn)定性強(qiáng)的數(shù)據(jù)庫是利用穩(wěn)定同位素開展有機(jī)茶鑒別的基礎(chǔ)。本研究廣泛調(diào)查了我國有機(jī)茶中穩(wěn)定同位素δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 范圍和分布情況。其中δ13C 值介于－31.0‰ ～ －23.7‰，與已有研究中不同產(chǎn)地的常規(guī)茶葉δ13C 范圍較為一致(－28.02‰～ －23.61‰)[25]。δ2H 和δ18O 范圍分別為－107.1‰ ～ －24.8‰和17.2‰ ～ 32.0‰，平均值分別為－49.4‰和26.9‰，不同地域間差異較大，但平均值和地域分布規(guī)律與已報道的常規(guī)茶葉中穩(wěn)定同位素結(jié)果基本一致[23，26－27]，推測δ2H 和δ18O 受施肥種類影響較小。已有研究表明，δ2H 和δ18O 均與緯度、海拔、降水、離海岸距離等因素相關(guān)[18－19]。本研究有效擴(kuò)充了我國有機(jī)茶穩(wěn)定同位素數(shù)據(jù)庫，探明了有機(jī)茶同位素特征分布情況及地域差異，為有機(jī)茶的鑒別研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

?

δ15N 是區(qū)別有機(jī)產(chǎn)品的重要指標(biāo)。已有研究表明，通常有機(jī)果蔬的δ15N 值大于5.0‰，有機(jī)大米的δ15N 值大于3.0‰[28]。中野明正等[13]測得日本有機(jī)茶中δ15N 值為6.8‰，試驗樣品已連續(xù)20年進(jìn)行有機(jī)栽培。馮海強(qiáng)等[29]根據(jù)質(zhì)量平衡原理推算得出有機(jī)茶中δ15N 值應(yīng)高于7‰。本研究測得我國有機(jī)茶中δ15N 值范圍為－5.2‰ ～ 6.6‰，有51%的樣品δ15N 值介于0 ～ 3.0‰，較其他研究中有機(jī)產(chǎn)品δ15N 值明顯偏低，推測與我國40%的有機(jī)茶尚處于轉(zhuǎn)換期有關(guān)?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)換期作物δ15N 值通常低于普通有機(jī)作物。如有機(jī)大米中δ15N 值為4.9‰ ～ 5.3‰，轉(zhuǎn)換期大米δ15N 值為3.5‰ ～ 4.6‰，常規(guī)栽培大米δ15N值為2.8‰ ～ 3.3‰[28]。Nobuyuki 等[14]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)栽培與普通栽培的茶葉在試驗初期δ15N 值差異不大，而連續(xù)5年有機(jī)栽培的茶葉δ15N 值明顯增加。同時，本研究結(jié)果表明有機(jī)茶生產(chǎn)面積大的地區(qū)樣品δ15N 值顯著高于生產(chǎn)面積小的地區(qū)樣品，推測是由于生產(chǎn)面積大的省份有更多的有機(jī)茶產(chǎn)品已渡過轉(zhuǎn)換期。其中云南和貴州氣候環(huán)境適宜，綠肥資源和茶樹良種資源豐富，適合發(fā)展有機(jī)茶產(chǎn)業(yè)。近年來兩省茶產(chǎn)業(yè)規(guī)模擴(kuò)張迅速，尤其重視高優(yōu)生態(tài)茶園建設(shè)和管理，有機(jī)茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速[30]。同時，我國有機(jī)茶園多使用餅肥作為有機(jī)肥料，如菜籽餅、茶籽餅、大豆餅等[31]，此類植物源有機(jī)肥δ15N 值通常低于動物源堆肥，這也可能是導(dǎo)致我國有機(jī)茶中δ15N 值偏低的原因之一。在已有報道中，我國部分產(chǎn)區(qū)的常規(guī)茶葉δ15N 值大多分布于3.0‰左右[23，25－27]，與本研究有機(jī)茶樣品中δ15N值無較大差異。推測是由于我國常規(guī)種植的茶葉存在化肥和有機(jī)肥混合使用的現(xiàn)象，并非完全使用化肥，使得常規(guī)茶的δ15N 值接近于有機(jī)茶。除了栽培管理因素，引起作物中δ15N差異的原因還包括土壤類型、前期土地利用、植物根系生長情況等因素[32]。此外，市場上有機(jī)茶中出現(xiàn)有機(jī)標(biāo)識假冒和誤標(biāo)的情況也難以避免，影響到研究樣品信息的真實性。目前我國有機(jī)茶種植范圍廣，各地茶園環(huán)境和管理能力差異較大，尚有大量有機(jī)茶處于轉(zhuǎn)換階段。因此，單純以δ15N 作為有機(jī)茶鑒別標(biāo)準(zhǔn)不夠科學(xué)和完善，需要挖掘更多能夠反映有機(jī)茶特征的指標(biāo)，同時結(jié)合化學(xué)計量學(xué)等方法開展有機(jī)茶鑒別研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，目前我國有機(jī)茶中δ13C、δ2H 和δ18O 與已有研究中常規(guī)茶表現(xiàn)基本一致，分別分布于－31.0‰ ～ －23.7‰、－107.1‰ ～ －24.8‰和17.2‰～ 32.0‰。相較于其他同位素，δ15N 作為有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品標(biāo)識指標(biāo)之一，其正態(tài)分布范圍是－4.6‰ ～ 7.0‰，表現(xiàn)為生產(chǎn)面積大的地區(qū)顯著高于生產(chǎn)面積小的地區(qū)。因此δ15N 具有成為有機(jī)茶鑒別重要指標(biāo)的潛力，但需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣品收集范圍，涵蓋更多地域及生長階段的樣品。同時，穩(wěn)定同位素溯源技術(shù)有待與其他鑒別技術(shù)相結(jié)合，完善信息追溯體系，利用多維信息融合技術(shù)更好地應(yīng)用于有機(jī)茶的真?zhèn)舞b別。