玉米生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因家族全基因組鑒定及表達(dá)分析

曹麗茹 張前進(jìn) 郭子寧 魯曉民 張 新 魏 昕 皇甫柏樹(shù) 王振華

(1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，河南 鄭州 450002；2河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技成果示范推廣處，河南 鄭州 450002；3焦作市農(nóng)林科學(xué)研究院，河南 焦作 454150)

生長(zhǎng)素在植物生長(zhǎng)的不同階段、不同部位及不同生理活動(dòng)中都發(fā)揮著重要的作用，如根的發(fā)育、細(xì)胞增殖、花器官發(fā)育等生物過(guò)程。其中生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(auxin response factor，ARF)主要通過(guò)結(jié)合下游基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件AuxRE (TGTCTC)來(lái)調(diào)控響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平[1]。目前擬南芥 (Arabidopsis thaliana)[2]、水稻(Oryza sativa)[3]、 楊樹(shù)(PopulusL.)[4]、玉米(Zea maysL.)[5]、蘋(píng)果(Malus pumilaMill.)[6]和黃瓜(Cucumis sativusL.)[7]等植物中分別鑒定出了23、25、39、31、29 和18 個(gè)ARF 成員，但在動(dòng)物和微生物中尚未鑒定到ARF 類(lèi)基因，表明ARF 家族是植物特有的。研究表明，ARFs 蛋白包含3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，位于NH2端植物特有的DNA 結(jié)合域B3(DNAbinding domain，DBD)、中間區(qū)域的激活或者抑制結(jié)構(gòu)(Auxin-resp 結(jié)構(gòu)域)和COOH 末端的二聚化結(jié)構(gòu)域(CTD)。B3 結(jié)構(gòu)與順式元件AuxRE 結(jié)合需要其他氨基酸的輔助，并且二者結(jié)合與外源生長(zhǎng)素的使用無(wú)關(guān)[8]；CTD 結(jié)構(gòu)域較保守，與Aux/IAAs 結(jié)構(gòu)域相似度較高，可產(chǎn)生二聚化區(qū)域[9]；對(duì)于中間區(qū)域，若氨基酸序列含有大量的谷氨酰胺、絲氨酸、亮氨酸該區(qū)域起激活作用，若這些氨基酸被脯氨酸、甘氨酸等代替該區(qū)域起抑制作用[10]。ARF 家族功能方面，研究表明AtARF5 在維管組織發(fā)育過(guò)程中起重要作用，是生長(zhǎng)素重要的轉(zhuǎn)錄激活子[11]；AtARF5 通過(guò)調(diào)節(jié)DORNROSCHEN(DRN)基因來(lái)間接調(diào)控植物子葉發(fā)育[12]；GmARF17主要在側(cè)根中表達(dá)，調(diào)控大豆[Glycine max(Linn.)Merr.]下胚軸發(fā)育[13]；OsARF1在水稻的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)期和生殖期均起著重要作用，該基因也是生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)的早期反應(yīng)調(diào)控因子[14]。

近年來(lái)研究表明，不僅脫落酸(abscisic acid，ABA)、乙烯、赤霉素等激素參與植物逆境脅迫過(guò)程，生長(zhǎng)素也參與這些過(guò)程[15－16]；生長(zhǎng)素合成路徑中的核黃素單加氧(YUCCAs)限速酶，其過(guò)量表達(dá)可以提高擬南芥的抗旱性[17]；此外，Xu 等[18]研究表明，茶樹(shù)(Camellia sinensisL.)CsARFs基因可能參與植物非生物脅迫和激素信號(hào)傳導(dǎo)路徑。玉米作為糧食、飼料和加工原料對(duì)保證糧食安全和農(nóng)民增收至關(guān)重要，但每年由于高溫、干旱等非生物脅迫造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損傷，故挖掘響應(yīng)逆境脅迫的基因，通過(guò)分子育種技術(shù)提高玉米的抗逆性對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前關(guān)于玉米ZmARFs基因的非生物脅迫響應(yīng)報(bào)道較少，本研究對(duì)鑒定到的36 個(gè)玉米ARFs 基因家族進(jìn)行系統(tǒng)的進(jìn)化關(guān)系、啟動(dòng)子區(qū)域的調(diào)控元件、多種非生物脅迫和激素誘導(dǎo)下基因的表達(dá)模式及組織表達(dá)特性進(jìn)行分析，以期為深入了解玉米ARFs家族成員的遺傳進(jìn)化及在玉米逆境脅迫中的功能提供理論基礎(chǔ)，為玉米抗逆育種提供優(yōu)異的分子資源。

1 材料與方法

1.1 玉米基因組中ARFs 基因的鑒定、染色體位置及蛋白的理化特性分析

通過(guò)Plant Transcription Factor Database (http:/ /planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)和Pfam (http:/ /pfam.xfam.org/)對(duì)玉米、高粱、擬南芥和水稻的ARFs 基因家族成員進(jìn)行篩選，去除無(wú)DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活或抑制結(jié)構(gòu)域的基因。利用Phytozome (https:/ /phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) 確定玉米ARFs的染色體位置，并使用MapChart 軟件繪制家族基因的染色體位置。利用在線軟件ProtParam (https:/ /web.expasy.org/protparam/)和Sopma (https:/ /npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page ＝npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)。

1.2 ARFs 蛋白的復(fù)合進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及分類(lèi)

利用Clustal W 對(duì)玉米、高粱、水稻和擬南芥的序列進(jìn)行比對(duì)，再利用MEGA5.0 中的鄰近法(neighborjoining，NJ，bootstrap ＝1 000)構(gòu)建復(fù)合進(jìn)化樹(shù)，根據(jù)進(jìn)化樹(shù)分支的距離，對(duì)ARFs 進(jìn)行分類(lèi)。

1.3 玉米ARFs 結(jié)構(gòu)域和共線性分析

根據(jù)NCBI 的CDD 下載玉米ARFs 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；采用MEME 在線工具分析ARFs 蛋白的保守基序，基序的最大數(shù)目設(shè)置為10；根據(jù)蛋白序列的相似性(大于75%)，利用R 語(yǔ)言中的RCircos 軟件繪制玉米、高粱、水稻和擬南芥ARFs 的共線性關(guān)系圖。

1.4 玉米ARFs 啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件及GO 功能分析

使用Plant care 在線預(yù)測(cè)ZmARFs啟動(dòng)子區(qū)域(ATG 上游2 000 bp)的順式調(diào)控元件；Ensemble plant下載玉米ARFs基因參與的GO 功能(細(xì)胞組分、分子功能和生物過(guò)程)。

1.5 玉米ARFs 基因的表達(dá)模式分析

以?xún)?yōu)異自交系鄭6541 為試驗(yàn)材料，玉米在Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中長(zhǎng)到三葉期時(shí)進(jìn)行處理:聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)處理(Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液＋20% PEG)、 NaCl處理(Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液＋200 mmol·L－1NaCl)、 ABA 處 理(Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液＋5 μmol·L－1ABA)和高溫處理(42℃)，分別在0、4、8、12和24 h 取4 個(gè)處理的葉片；以玉米自交系B73 為材料，取正常水分下生長(zhǎng)的根、莖、葉、雄穗、雌穗、胚和胚乳作為基因組織表達(dá)特性分析，三株相同部位混為一個(gè)樣品，每個(gè)部位取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

根據(jù)ZmARFs基因序列設(shè)計(jì)特異引物，引物合成在北京華大基因公司完成。使用EasyPure RNA Purification Kit(上海翊圣生物科技有限公司)提取上述樣品的總RNA，TansScrip One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis 試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以玉米18S為內(nèi)參基因，使用SYBR Premix Ex TaqTM 試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，采用兩步法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-qPCR):95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)2－△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 玉米ARFs 蛋白的亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)玉米ARFs基因的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)序列設(shè)計(jì)引物，將克隆到的ZmARFs基因的ORF 序列裝載到熒光表達(dá)載體pMDC83 上，然后轉(zhuǎn)化至EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將含有陽(yáng)性克隆的農(nóng)桿菌采用注射法侵染6 葉期的煙草葉片，2 d 后在共聚焦熒光顯微鏡下觀察注射農(nóng)桿菌的葉片部位的綠色熒光蛋白的位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmARFs 基因的鑒定及理化特性分析

通過(guò)對(duì)ZmARFs基因家族成員進(jìn)行篩選，最終確定36 個(gè)ZmARFs基因，暫將其命名為ZmARF1 ～ZmARF36(表1)。除了B3 和ARF 結(jié)構(gòu)域，ZmARF1、ZmARF3、ZmARF6～ZmARF8 等19 個(gè)基因還含有AUX_IAA 結(jié)構(gòu)域。編碼ZmARF 蛋白的氨基酸長(zhǎng)度范圍從273aa(ZmARF9)到1 147aa(ZmARF23)，分子量從29.73 kDa(ZmARF9)到127.24 kDa(ZmARF11)，等電點(diǎn)從5.41(ZmARF34)到8.77(ZmARF32)。這些蛋白的氨基酸長(zhǎng)度和蛋白特性相差均較大，表明ZmARF家族成員特性不同，在生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮不同的作用。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，這些蛋白α－螺旋所占蛋白序列比例范圍是14.35%(ZmARF4)～37.42%(ZmARF36)，β－轉(zhuǎn)角所占蛋白序列比例范圍是3.16%(ZmARF30)～8.47%(ZmARF1)，無(wú)規(guī)則卷曲所占蛋白序列比例范圍是42.36%(ZmARF36)～66.32%(ZmARF29)，延伸鏈的范圍是 13.09% ( ZmARF29 ) ～ 22.35%(ZmARF31)，表明這些蛋白由α－螺旋、β－轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈4 種結(jié)構(gòu)組成，且無(wú)規(guī)則卷曲是主要的存在形式。

ZmARFs基因所在的染色體物理位置定位分析顯示(圖1)，36 個(gè)基因隨機(jī)不均勻地分布在玉米的10 條染色體上(除第7 染色體外)，分別分布著5、5、6、4、6、3、2、1 和4 個(gè)ZmARFs基因。分析發(fā)現(xiàn)，ZmARFs基因大多位于染色體兩端，僅1 號(hào)(ZmARF1～ZmARF5)、3 號(hào)(ZmARF12、ZmARF13、ZmARF114)、4 號(hào)(ZmARF18 和ZmARF19)和6 號(hào)(ZmARF28)染色體上的基因位于染色體中部。此外，1 號(hào)染色體上的ZmARF4 和ZmARF5，2號(hào)染色體的ZmARF7 和ZmARF8、ZmARF9 和ZmARF10，10 號(hào)染色體的ZmARF34 和ZmARF35 所在的物理位點(diǎn)較近。

2.2 不同作物ARFs 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)獲得的擬南芥(22 個(gè))、水稻(27 個(gè))、高粱(25個(gè))和玉米(36 個(gè))的ARF 蛋白，利用MEGA 的NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。整個(gè)進(jìn)化樹(shù)分為四大類(lèi)(Ⅰ～Ⅳ)，其中Ⅱ類(lèi)含有較多的同系或旁系同源物，根據(jù)不同物種蛋白序列相似程度又細(xì)分為IIa、IIb 和IIc。玉米的36 個(gè)ARF 蛋白主要聚在第Ⅱ分支(14個(gè))的IIb 上(9 個(gè))，其次是第Ⅲ分支(11 個(gè))，而IIa亞分支上只含有擬南芥的6 個(gè)ARF 蛋白?？傮w來(lái)看，其他分支上均含有4 個(gè)物種的ARF 蛋白，并且玉米的ARF 蛋白家族與高粱的ARF 蛋白家族親緣關(guān)系較近，與水稻的親緣關(guān)系次之，與擬南芥的關(guān)系最遠(yuǎn)。此外，IIb 分支上的ZmARF13 和ZmARF30、 ZmARF4 和ZmARF5 聚在一個(gè)小分支上，說(shuō)明ZmARF13 和ZmARF30、ZmARF4 和ZmARF5 蛋白進(jìn)化關(guān)系更近。

2.3 不同作物ARFs 蛋白的共線性分析

蛋白共線性分析是以不同物種基因編碼的蛋白序列為對(duì)象，根據(jù)蛋白序列相似性來(lái)探究物種內(nèi)或物種間存在的同系或旁系同源對(duì)，及潛在的進(jìn)化關(guān)系。本研究為了進(jìn)一步分析擬南芥、水稻、高粱和玉米間的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)4 個(gè)物種進(jìn)行。如圖3 共線性片段分析可知，玉米與高粱直系同源的家族成員有17 個(gè)、與水稻直系同源的家族成員有2 個(gè)，高粱與水稻直系同源家族成員有4 個(gè)，但高粱、玉米、水稻均與擬南芥無(wú)直系同源片段。旁系同源關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)玉米家族成員含有2 對(duì)旁系同源，高粱含有1 對(duì)、水稻含有1 對(duì)、擬南芥有3 對(duì)。

2.4 玉米ARFs 基因的順式作用元件分析

Plant care 在線對(duì)ZmARFs基因起始密碼子上游2 000 bp 序列進(jìn)行順式調(diào)控元件分析(表2)，發(fā)現(xiàn)這些基因除了含有基本的核心元件和光響應(yīng)元件外，還存在多個(gè)順式元件，激素類(lèi)如ABA、生長(zhǎng)素、茉莉酸甲酯、赤霉素、水楊酸響應(yīng)元件，非生物脅迫類(lèi)如干旱、低溫、滲透脅迫及厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的調(diào)控元件，除此調(diào)控元件外，ZmARF1、ZmARF2 和ZmARF3 啟動(dòng)子區(qū)還含有分生組織表達(dá)相關(guān)的元件。表明玉米在遭遇脅迫時(shí)，可以通過(guò)結(jié)合這些順式元件來(lái)調(diào)控ZmARFs基因的表達(dá)，從而抵御脅迫。

表2 ZmARFs 基因家族啟動(dòng)子區(qū)順式元件Table 2 Cis-element regulatory in prometer of ZmARFs gene family

2.5 玉米ARFs 基因的GO 功能富集分析

對(duì)36 個(gè)ZmARFs基因進(jìn)行GO 注釋分析(圖4)，這些基因參與分子生物學(xué)功能(GO:0003677-DNA 結(jié)合，GO:0005515－蛋白結(jié)合，GO:0042802－一致性蛋白結(jié)合，GO:0003700－轉(zhuǎn)錄因子活性)、生物學(xué)過(guò)程(GO:0006355－轉(zhuǎn)錄調(diào)控，GO:0009734－激活生長(zhǎng)素信號(hào)通路，GO:0010150－葉片衰老，GO:0010158－細(xì)胞遠(yuǎn)軸，GO:0010582－花分生組織，GO:0045892－轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控，GO:0051301－細(xì)胞分裂，GO:0009908－根發(fā)育，GO:0048607－分生組織發(fā)育)和細(xì)胞學(xué)組分(GO:0005634－細(xì)胞核)。分析發(fā)現(xiàn)ZmARFs基因多富集在GO:0003677-DNA 結(jié)合、GO:0005515 －蛋白結(jié)合、GO:0006355－轉(zhuǎn)錄調(diào)控、GO:0009734－激活生長(zhǎng)素信號(hào)通路、GO:0005634－細(xì)胞核等路徑上，說(shuō)明玉米ARFs家族多個(gè)成員主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)路徑。此外，發(fā)現(xiàn)ZmARF7 還參與根發(fā)育和分生組織發(fā)育；而ZmARF6 和ZmARF20 基因主要參與葉片衰老、轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控和細(xì)胞分裂。

2.6 玉米ARFs 基因的組織表達(dá)分析

通過(guò)分析ZmARF1、ZmARF6、ZmARF13 和ZmARF22 基因在根、莖、葉、雌穗、雄穗、花藥、胚和胚乳組織中的表達(dá)(圖5)，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)基因均在雄穗中高表達(dá)，而在花藥中表達(dá)量最低，其中差別最大的是ZmARF22(160 倍)，差別最小的是ZmARF1(50 倍)；4個(gè)基因在胚中的表達(dá)量均高于在胚乳中的表達(dá)量(3.5～22 倍)。此外，ZmARF1 在莖和雌穗中相對(duì)表達(dá)量也較高，其他3 個(gè)基因在根中相對(duì)表達(dá)量較高。

2.7 玉米ARFs 基因響應(yīng)非生物和激素誘導(dǎo)的表達(dá)分析

由圖6 可知，ZmARF1、ZmARF6 和ZmARF13 基因均強(qiáng)烈響應(yīng)外源ABA 處理，在ABA 處理后的2、4、12和24 h 表達(dá)量均顯著上調(diào)表達(dá)，其中ZmARF1 和ZmARF22 在處理2 h 達(dá)到最高峰，分別是對(duì)照的10.8和5.4 倍；ZmARF6 和ZmARF13 在處理4 h 達(dá)到最高峰，分別是對(duì)照的15.9 和12.3 倍。高溫脅迫下，ZmARF1、ZmARF6 和ZmARF13 在4 個(gè)脅迫時(shí)間點(diǎn)均顯著上調(diào)表達(dá)，且在脅迫初期2 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，分別是對(duì)照的2.7、4.6 和6.7 倍；而ZmARF22 基因在脅迫后表達(dá)量降低。NaCl 脅迫時(shí)，除ZmARF22外其他3 個(gè)基因的表達(dá)量均高于對(duì)照，ZmARF6 基因在脅迫2 h 時(shí)表達(dá)達(dá)到最高峰，是對(duì)照的2.6 倍；ZmARF1、ZmARF13 和ZmARF22 基因在脅迫12 h 時(shí)表達(dá)達(dá)到最高峰，分別是對(duì)照的4.6、7.8 和2.4 倍。PEG 脅迫下，4 個(gè)基因的表達(dá)均高于對(duì)照，達(dá)到顯著水平，且都在脅迫4 h 達(dá)到表達(dá)最高峰，分別是對(duì)照的11.5、6.4、12.6 和3.2 倍。

2.8 玉米ARFs 蛋白的亞細(xì)胞定位分析

為了探究玉米ARFs 蛋白的作用機(jī)制，本研究對(duì)ZmARF1、ZmARF6、ZmARF13 和ZmARF22 基因編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果如圖7 所示。對(duì)照35S:GFP 在煙草的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)核中均有表達(dá)，而35S:ZmARF1-GFP、 35S: ZmARF6-GFP、 35S: ZmARF13-GFP 和35S:ZmARF22-GFP 融合蛋白只在細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光信號(hào)，說(shuō)明ZmARF1、ZmARF6、ZmARF13 和ZmARF22 基因編碼的蛋白位于細(xì)胞核，屬于核蛋白，具有轉(zhuǎn)錄因子的一般特性。

3 討論

植物特有的轉(zhuǎn)錄因子ARF 已經(jīng)在多個(gè)物種的全基因水平上被鑒定到，其可通過(guò)結(jié)合下游功能基因啟動(dòng)子上的順式作用元件來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。本研究通過(guò)全基因組水平，以ARF 轉(zhuǎn)錄因子特有的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域B3 和ARF(Auxin_resp)，從玉米中鑒定出了36個(gè)ARF 家族成員，可能是玉米ARF 發(fā)生了基因復(fù)制，或鑒定方法不同等原因?qū)е虏煌锓N間家族成員不一致?？傮w而言，不同物種間ARF 家族成員數(shù)目存在差異，這一現(xiàn)象可能與全基因組的復(fù)制相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)玉米ARFs 蛋白的氨基酸長(zhǎng)度、分子量、等電點(diǎn)及α－螺旋、β－轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈均存在很大的差異，可能與家族成員在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能機(jī)制不同有關(guān)。此外，本研究中玉米36 個(gè)ARFs家族成員廣泛而非均勻分布于玉米9 條染色體上，ZmARFs基因家族未出現(xiàn)基因簇，這與擬南芥和水稻研究結(jié)果一致[2－3]。但在玉米1 號(hào)染色上的ZmARF4 和ZmARF5，2 號(hào)染色染色體的ZmARF7 和ZmARF8、ZmARF9 和ZmARF10，10 號(hào)染色體的ZmARF34 和ZmARF35 所在的物理位點(diǎn)較近，可能與基因家族的基因復(fù)制有關(guān)，這些位點(diǎn)相近的基因或許在功能上較為相似，這一結(jié)果為探究玉米ARFs基因家族的作用機(jī)制提供了理論參考。

本研究發(fā)現(xiàn)，玉米、高粱、水稻和擬南芥的ARF 蛋白成員分為Ⅰ～Ⅳ四大類(lèi)，四個(gè)分支分別包含5、14、11和6 個(gè)玉米ARFs 蛋白，說(shuō)明玉米ARFs 蛋白家族成員間存在較為廣泛的多樣性，可能與B3、ARF 和AUX_IAA 結(jié)構(gòu)域的保守性有關(guān)。此外，玉米ARFs 蛋白家族親緣關(guān)系與高粱最近、水稻次之、擬南芥最遠(yuǎn)，這可能與玉米和高粱屬于單子葉C4植物，水稻為單子葉C3植物，擬南芥為雙子葉C3植物有關(guān)，同時(shí)暗示高粱與玉米可能存在相同的分化，但玉米內(nèi)又發(fā)生了基因復(fù)制?；驈?fù)制分為基因內(nèi)復(fù)制和基因間復(fù)制，是植物進(jìn)化過(guò)程中普遍存在的一種現(xiàn)象，是基因擴(kuò)張和物種進(jìn)化的一個(gè)重要方式[19－20]。本研究發(fā)現(xiàn)旁系基因?qū)mARF4 和ZmARF5 位于第1 號(hào)染色體，ZmARF13和ZmARF30 分別位于第3 和第8 號(hào)染色體，前者屬于基因內(nèi)復(fù)制，后者屬于基因間復(fù)制。結(jié)果表明玉米ARFs家族通過(guò)基因內(nèi)復(fù)制和基因間復(fù)制來(lái)增加家族成員的數(shù)目，促進(jìn)玉米的進(jìn)化，同時(shí)暗示不同類(lèi)型的ARFs基因家族成員存在不同的進(jìn)化途徑和速度。

不同組織和器官的表達(dá)模式分析在很大程度上可以預(yù)測(cè)基因涉及的生命過(guò)程和分子功能。本研究發(fā)現(xiàn)ZmARF1、ZmARF6、ZmARF13 和ZmARF22 在玉米根、莖、葉、雄穗、雌穗、花粉及果實(shí)等不同器官中均表達(dá)，屬于組成型基因，在番茄和蘋(píng)果等作物中也獲得了相似的結(jié)果[21－22]。這4 個(gè)基因均在雄穗分支和胚中表達(dá)量較高，在花粉中表達(dá)量較低，但ZmARF1 在莖中相對(duì)表達(dá)量較高，其他3 個(gè)基因在根中相對(duì)表達(dá)量較高。說(shuō)明玉米ARFs基因參與玉米生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，但在不同器官生長(zhǎng)和發(fā)育中的作用既存在相似性又具有不同的生物學(xué)功能。水稻和擬南芥中多數(shù)ARFs基因存在組織特異表達(dá)，同時(shí)對(duì)不同的非生物脅迫選擇表達(dá)或者不表達(dá)[23]?；騿?dòng)子順式調(diào)控元件的分析可以預(yù)測(cè)基因潛在的分子功能和機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)玉米ARFs 基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域含有多種響應(yīng)元件，如干旱、氧化、低溫、防御和應(yīng)激響應(yīng)元件、生長(zhǎng)素、脫落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、水楊酸植物激素類(lèi)響應(yīng)元件等，表明ZmARFs基因的表達(dá)受多種因素調(diào)控，參與植物的逆境脅迫和生長(zhǎng)發(fā)育等。

非生物脅迫(高溫、干旱和鹽)和激素誘導(dǎo)(ABA)的結(jié)果表明，ZmARF1、ZmARF6、ZmARF13 基因在高溫干旱、鹽和ABA 誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)模式一致，均顯著上調(diào)表達(dá)。這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域均含有干旱響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件等，啟動(dòng)子順式調(diào)控元件和熒光定量表達(dá)模式的分析證實(shí)了二者結(jié)果的可靠性。其中，ZmARF1 和ZmARF13 基因在干旱、高溫、鹽脅迫及ABA 誘導(dǎo)時(shí)上調(diào)表達(dá)的幅度最大，推斷這2 個(gè)基因可能是參與非生物脅迫和激素誘導(dǎo)應(yīng)答的主要基因，結(jié)果為進(jìn)一步研究抗逆基因提供儲(chǔ)備資源。但4 個(gè)基因的表達(dá)最高峰所在的脅迫點(diǎn)不同，結(jié)合ZmARF22 基因在高溫脅迫的4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式與其他基因的模式相反的結(jié)果，推測(cè)玉米ARFs基因響應(yīng)非生物脅迫和激素誘導(dǎo)的表達(dá)模式存在差異，且具有階段性，或許響應(yīng)機(jī)制存在差異。其他物種也有報(bào)道ARFs基因參與非生物脅迫的生物學(xué)過(guò)程[24－27]。

基因表達(dá)后翻譯成蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能，因此了解蛋白質(zhì)的位置有助于研究基因的功能及作用機(jī)制[28]。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示ZmARF1、ZmARF6、ZmARF13 和ZmARF22 基因編碼的蛋白質(zhì)，定位于細(xì)胞核，屬于核蛋白，這為進(jìn)一步研究這4 個(gè)基因的作用機(jī)制提供了理論參考。關(guān)于ZmARF基因家族響應(yīng)逆境脅迫的機(jī)制還需要后續(xù)進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法，在全基因組水平鑒定了玉米36 個(gè)ARF 基因家族成員，發(fā)現(xiàn)玉米與高粱的親緣關(guān)系較近，且玉米發(fā)生了基因內(nèi)復(fù)制和基因間復(fù)制。6 個(gè)ZmARFs基因啟動(dòng)子區(qū)域含有大量的響應(yīng)非生物脅迫及激素類(lèi)元件，主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)路徑。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)ZmARF1、ZmARF6、ZmARF13 和ZmARF22 基因均在雄穗分支和胚中表達(dá)量較高，在花粉中表達(dá)量較低。ZmARF1、ZmARF6、ZmARF13 和ZmARF22 基因表達(dá)量受干旱、鹽和ABA 誘導(dǎo)，且4 個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)屬于核蛋白，為后續(xù)機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。