芒果核多酚超聲輔助提取工藝優(yōu)化及抑菌活性研究

劉曉珍，李福香，祝兆亮，梁卓恒，彭高怡，李琳*

（1.東莞理工學(xué)院化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院，廣東 東莞 523808；2.東莞理工學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)健康工程與智能化加工研究中心，廣東 東莞 523808）

芒果（Mangifera indica Linnaeus）是漆樹(shù)科芒果屬植物的果實(shí)，產(chǎn)于熱帶、亞熱帶。我國(guó)是芒果主要生產(chǎn)國(guó)之一，資源豐富[1]。在加工過(guò)程中，芒果除了制成干果、罐頭外，占芒果總質(zhì)量20%～60%的果皮和果核一般都被丟棄或用作飼料，造成了極大的浪費(fèi)和環(huán)境污染。通過(guò)對(duì)芒果的大量研究，發(fā)現(xiàn)芒果富含多種酚類物質(zhì)，而90%的多酚位于工業(yè)廢棄物芒果核中，果核多酚具有很高的研究?jī)r(jià)值[2-4]。植物多酚具有清除體內(nèi)自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、預(yù)防心血管疾病、延緩機(jī)體衰老、預(yù)防癌癥等生物活性[5-7]。如白藜蘆醇、槲皮素、茶多酚等可以提高機(jī)體內(nèi)源性抗氧化防御能力，從而保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷[8-10]。Zhi等[11]通過(guò)研究昆侖雪菊提取物，發(fā)現(xiàn)雪菊多酚能夠抑制小鼠肝臟受氧化應(yīng)激損傷。目前，植物多酚的提取方法主要有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法等。超聲輔助提取，是利用“空穴作用”破壞植物細(xì)胞壁，使得多酚釋放，因其溫度較低，可以最大程度保持多酚的生物活性[12]。因此，尋找超聲輔助提取芒果核多酚的最佳工藝條件具有重要意義。同時(shí)，多酚活性是其功能性質(zhì)的重要體現(xiàn)，研究芒果核多酚抑菌活性可在一定程度上反映超聲波輔助提取條件下多酚的生物功能。

因此，本文以芒果核為原料，研究芒果核多酚超聲波輔助提取的最佳工藝條件，并從抑菌活性方面評(píng)價(jià)芒果核多酚的生物活性，以期為芒果的進(jìn)一步高效開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥芒果核：市售；沒(méi)食子酸、無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水乙醇（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；牛肉浸膏：上海德榜化工有限公司；細(xì)菌學(xué)蛋白胨、技術(shù)瓊脂：廣州市鴻洲實(shí)驗(yàn)器材科技有限公；其它試劑均為普通分析純。大腸桿菌、枯草芽孢桿菌：東莞理工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與設(shè)備

KG-400DE型數(shù)控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（Ш）型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；JA1003型電子精密天平：湖南力辰儀器科技有限公司；752N型紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；YM50型高壓蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰公司；DFY-1000C小型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：大德藥機(jī)生產(chǎn)廠家。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將購(gòu)買的芒果核用小型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)200目篩，自封袋分裝后置于干燥器中備用。

1.3.2 芒果核多酚提取

芒果核多酚提取參照康超等[4]方法，并稍作修改。精確稱取預(yù)先干燥、粉碎的芒果核粉末2 g，按照料液比 1∶20（g/mL）、乙醇濃度 60%、超聲功率 320 W、超聲時(shí)間60 min，超聲萃取芒果核多酚，萃取液3 500 r/min離心10 min后抽濾，于45℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約5mL，蒸餾水定容至10 mL，得芒果核多酚提取液。

1.3.3 芒果核多酚含量測(cè)定

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：方法參照參考文獻(xiàn)[13-14]略加修改。準(zhǔn)確稱取沒(méi)食子酸5 mg，加入到50 mL容量瓶中，定容，搖勻，得到濃度為0.1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL于具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)足體積到5 mL。然后分別加入福林酚試劑1.0 mL，充分振蕩后靜置3 min～4 min。往各具塞試管中加入75 g/L Na2CO3溶液2 mL，50℃恒溫水浴反應(yīng)5 min后取出，降至室溫（25℃），于760 nm處測(cè)定其吸光度值，以不加沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液為參比。以沒(méi)食子酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=21.424x-0.005 1，式中y為吸光度值，x為沒(méi)食子酸質(zhì)量，相關(guān)系數(shù)為0.999 6。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallic acid concentration-absorbance value of the standard curve

芒果核多酚含量測(cè)定：取0.2 mL提取液（可作適當(dāng)稀釋），用去離子水補(bǔ)至1 mL，同標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作測(cè)定芒果核樣品多酚含量，結(jié)果以每克芒果核粉末中所含沒(méi)食子酸當(dāng)量表示（mg GAE/g）。每個(gè)樣品做3組平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.3.4 芒果核多酚提取單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 料液比的篩選

準(zhǔn)確稱取芒果核粉末 2 g，以料液比 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）分別加入 60%乙醇溶液，于超聲功率320 W超聲60 min，按1.3.2方法提取多酚，測(cè)定多酚含量，并計(jì)算多酚提取得率，確定適宜料液比。

1.3.4.2 乙醇濃度的篩選

準(zhǔn)確稱取芒果核粉末 2 g，以料液比 1∶20（g/mL）分別加入20%、40%、60%、80%乙醇溶液，于超聲功率320 W超聲60 min，按1.3.2方法提取多酚，測(cè)定多酚含量，并計(jì)算多酚提取得率，確定適宜乙醇濃度。

1.3.4.3 超聲時(shí)間的篩選

準(zhǔn)確稱取芒果核粉末 2 g，以料液比 1∶20（g/mL）加入60%乙醇溶液，于超聲功率320 W分別超聲60、80、100、120 min，按1.3.2方法提取多酚，測(cè)定多酚含量，并計(jì)算多酚提取得率，確定適宜超聲時(shí)間。

1.3.4.4 超聲功率的篩選

準(zhǔn)確稱取芒果核粉末 2 g，以料液比 1∶20（g/mL）加入60%乙醇溶液，分別于超聲功率160、240、320、400 W超聲60 min，按1.3.2方法提取多酚，測(cè)定多酚含量，并計(jì)算多酚提取得率，確定適宜超聲功率。

1.3.5 正交試驗(yàn)

以單因素結(jié)果為參考，對(duì)料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲功率進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)，以芒果核多酚得率為指標(biāo)，用L9（34）正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝。

1.3.6 芒果核多酚抑菌活性試驗(yàn)

采用濾紙圓片法測(cè)定芒果核多酚對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的抑制作用。將已滅菌的直徑為5 mm小濾紙片分別浸入濃度為0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/mL的芒果核多酚溶液，每個(gè)樣品浸入3張小濾紙片。浸透18 h后，將濾紙片貼入均勻涂布大腸桿菌或枯草芽孢桿菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂平板中，將平板倒置放入恒溫箱，37℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。抑菌能力以抑菌圈的直徑表示，抑菌圈越大，表明抑菌效果越強(qiáng)。同時(shí)試驗(yàn)以無(wú)菌蒸餾水為空白對(duì)照。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果核多酚提取工藝研究

2.1.1 料液比對(duì)芒果核多酚得率的影響

料液比是影響提取效率的重要因素，適當(dāng)?shù)牧弦罕炔粌H能使得提取效率增高，也可減少浪費(fèi)和節(jié)省成本。料液比對(duì)芒果核多酚得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)芒果核多酚得率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on the yield of mango core polyphenols

從圖2可知，隨著料液比的降低，芒果核多酚得率逐漸增大，在料液比為 1∶40（g/mL）時(shí)，得率達(dá)到最大，當(dāng)料液比進(jìn)一步降低，得率下降。其原因可能是溶劑不足時(shí)原料中酚類物質(zhì)提取不充分，隨著溶劑增多，多酚溶出率增加，當(dāng)溶劑達(dá)到一定值時(shí)，多酚基本溶出[15]。此時(shí)增加溶劑多酚溶出率不再改變，而溶劑過(guò)量時(shí)蒸發(fā)時(shí)間太長(zhǎng)，可能導(dǎo)致多酚在溶劑蒸發(fā)時(shí)損失。因此，本試驗(yàn)確定1∶40（g/mL）為最佳提取料液比。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)芒果核多酚得率的影響

研究表明，不同來(lái)源多酚因其組成不同，起抗氧化作用的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)也不同[16-17]，導(dǎo)致在不同極性溶劑中的分散程度差異。水的極性比乙醇大，不同濃度的乙醇極性不同。乙醇濃度對(duì)芒果核多酚得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇濃度比對(duì)芒果核多酚得率的影響Fig.3 The effect of ethanol concentration on the yield of mango core polyphenols

從圖3可知，隨著乙醇濃度的增加，芒果核多酚得率先增加后降低，在乙醇濃度為40%時(shí)多酚提取得率達(dá)到最大，繼續(xù)增加乙醇濃度提取率開(kāi)始下降。這可能與芒果核多酚的組成及溶劑的性質(zhì)有關(guān)。因此，本試驗(yàn)確定40%乙醇為最佳溶劑濃度。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)芒果核多酚得率的影響

超聲時(shí)間比對(duì)芒果核多酚得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間比對(duì)芒果核多酚得率的影響Fig.4 The effect of extraction time on the yield of mango core polyphenols

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的增加，芒果核多酚提取得率先升高后降低，在超聲時(shí)間為100 min時(shí)，得率達(dá)到最大，當(dāng)超聲時(shí)間進(jìn)一步增加，得率開(kāi)始顯著下降。這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，溫度升高，破壞了多酚結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致多酚得率下降。因此，本試驗(yàn)確定最佳超聲時(shí)間為100 min。

2.1.4 超聲功率對(duì)芒果多酚得率的影響

超聲功率比對(duì)芒果核多酚得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 超聲功率比對(duì)芒果核多酚得率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic power on the yield of mango core polyphenols

由圖5可知，在160 W～320 W范圍內(nèi)，隨超聲功率的增加，多酚得率提高，當(dāng)功率達(dá)到320 W時(shí)，得率達(dá)到最大，而繼續(xù)增大超聲功率時(shí)得率卻降低。這可能是由于隨著功率的增加，超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)能量不斷增加，加強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的擴(kuò)散及溶解，增強(qiáng)多酚的釋放，使得多酚得率升高。當(dāng)超聲功率達(dá)到320 W時(shí)，多酚已基本析出，而超聲功率過(guò)大時(shí)可能破壞多酚結(jié)構(gòu)，使得多酚得率下降。因此，本試驗(yàn)確定最佳超聲功率為320 W。

2.1.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。以多酚提取得率為指標(biāo)，通過(guò)試驗(yàn)方案對(duì)得率的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test design

表 2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9（34）orthogonal test program and results

由表2可知，料液比、超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度對(duì)超聲波輔助提取芒果核多酚的影響的主次順序?yàn)榱弦罕龋ˋ）＞超聲時(shí)間（C）＞超聲功率（D）＞乙醇濃度（B）。其中，對(duì)得率的影響因素料液比＞提取時(shí)間＞乙醇濃度與微波輔助提取中一致[18]。從芒果核多酚的提取得率可知，超聲提取的最佳工藝條件為A1B1C1D1，即料液比為 1∶35（g/mL）、乙醇濃度為 35%、超聲時(shí)間為80min、超聲功率為280W，此條件下多酚得率為8.18%。

2.2 芒果核多酚的抑菌活性研究

芒果核多酚對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖的抑制作用如表3所示。

表3 芒果核多酚對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果Table 3 The mango core polyphenols antibacterial activity test results（mm，n=3）

由表3可知，當(dāng)芒果核多酚濃度達(dá)到0.05 mg/mL時(shí)，芒果核多酚對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有顯著抑制作用（P<0.05），且抑菌圈直徑隨多酚濃度的增加而增大。多酚濃度為0.05 mg/mL～0.2 mg/mL時(shí)，芒果核多酚抑制枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑顯著低于大腸桿菌（P<0.05），而多酚濃度為0.400 mg/mL時(shí)，兩者抑菌圈直徑無(wú)顯著差異（P>0.05）。這表明，芒果核多酚濃度為0.050 mg/mL～0.200 mg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于枯草芽孢桿菌，而多酚濃度為0.400 mg/mL時(shí)對(duì)二者抑制作用相當(dāng)。綜上，芒果核多酚濃度大于0.050 mg/mL時(shí)具有顯著抑菌活性，且對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。這與文獻(xiàn)報(bào)道芒果核多酚具有一定抑菌活性相一致[18-19]。另外，研究報(bào)道，芒果核多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性[20]，其抑菌活性可能與其抗氧化活性具有一定的相關(guān)性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取芒果核多酚，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝為：料液比1∶35（g/mL），超聲時(shí)間 80 min，乙醇濃度 35%，超聲功率280 W，該條件下芒果核多酚的提取率為8.18%。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)芒果核多酚活性的研究，發(fā)現(xiàn)芒果核多酚濃度大于0.050 mg/mL時(shí)具有顯著抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌活性，且對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。本文研究結(jié)果可在一定程度上為芒果核的進(jìn)一步利用提供理論依據(jù)。