巴東皺皮木瓜在發(fā)育過(guò)程中主要成分的變化規(guī)律

王婷婷 林健 屈鵬飛 潘章豪 鄧仕明

摘要：本文以湖北巴東產(chǎn)的皺皮木瓜為實(shí)驗(yàn)材料，分別在皺皮木瓜果實(shí)7個(gè)不同生長(zhǎng)期采樣，通過(guò)果實(shí)顏色、縱橫徑、鮮果重等形態(tài)特征的測(cè)定，并采用HPLC法對(duì)不同生長(zhǎng)期內(nèi)的有效成分（齊墩果酸、熊果酸、原兒茶酸、綠原酸）進(jìn)行檢測(cè)，綜合評(píng)價(jià)皺皮木瓜最佳的采收季節(jié)和質(zhì)量指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：（1）皺皮木瓜的縱徑、橫徑、鮮果重增長(zhǎng)隨生長(zhǎng)階段逐漸遞增。（2）在不同生長(zhǎng)期有效成分含量呈上升或者下降的趨勢(shì)。其中，齊墩果酸和熊果酸含量在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中逐漸增加，7.10號(hào)到7.20號(hào)增加較為明顯，兩者在成熟期達(dá)到最大值，原兒茶酸和綠原酸在幼果期時(shí)保持較高的含量，兩者變化趨勢(shì)為降-升-降。

關(guān)鍵詞：皺皮木瓜;HPLC;采收期;有效成分;

Abstract Made in this paper， taking hubei badong wrinkled skin papaya as experiment material， wrinkled skin papaya fruit in seven different growing period sampling， through the fruit color， the determination of vertical and horizontal diameter and fresh weight， morphological characteristics， and by the method of HPLC， the active components of different growth period （oleanolic acid， ursolic acid， protocatechuic acid， chlorogenic acid）， wrinkled skin papaya comprehensive evaluation of the optimal harvesting season and quality indicators.The results showed that ： （1） the longitudinal diameter， transverse diameter and fresh fruit weight of papaya increased gradually with the growth stage.（2） The content of active ingredients showed a trend of increasing or decreasing in different growth periods.The contents of oleanolic acid and ursolic acid increased gradually during the whole development process， and increased significantly from July 10 to July 20. The contents of both reached the maximum at the maturity stage， while the contents of protocatechuic acid and chlorogenic acid remained relatively high at the young fruit stage， and the variation trend of them was descending - ascending - descending.

Key words：Chaenomeles speciosa;HPLC;Harvest period;Active ingredients

項(xiàng)目資助：恩施州特色植物資源種質(zhì)工程技術(shù)中心建設(shè)項(xiàng)目（2019-2021）;湖北省“雙一流”建設(shè)專項(xiàng)資金（2019-2020）、風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（PT022014）、國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（201910517008）。

作者信息：王婷婷（1998.9-），女，四川樂(lè)至人，園藝專業(yè)本科生。

通訊作者：鄧仕明（1981.1-），男，湖北巴東人，講師，從事植物學(xué)方面的研究工作。

皺皮木瓜（拉丁文名：Chaenomeles speciosa （Sweet） Nakai）別名：木瓜、楙、貼梗海棠、貼梗木瓜、湯木瓜、宣木瓜等，屬于薔薇科植物，果實(shí)可人藥。皺皮木瓜為傳統(tǒng)中藥，性溫味酸， 有舒筋、活絡(luò)、健脾開(kāi)胃、舒肝止痛、祛風(fēng)除濕之功效， 可用于預(yù)防和治療風(fēng)濕、霍亂、痢疾、腸炎、腳氣病及維生素C缺乏癥等[1]。皺皮木瓜原產(chǎn)我國(guó)且廣有分布，但主產(chǎn)于安徽、四川、山東、浙江、湖北、云南等地[2]。

齊墩果酸具有多種生物活性： 如增強(qiáng)免疫和免疫調(diào)解、抑制血小板凝集、降血脂、抗病毒、抗艾滋病毒、消炎等作用[3，4];熊果酸也具有多種生物學(xué)活性， 尤其是在保肝、降血脂、抗腫瘤、抗氧化方面作用顯著[5，6];原兒茶酸具有增加冠脈流量、降低心肌耗氧量、緩解心絞痛等作用[7];綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有清除自由基，抗菌消炎，保肝利膽，抑制腫瘤，降血壓，降血脂及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用[8]。

巴東地處湖北西部，屬亞熱帶季風(fēng)和季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，終年濕潤(rùn)，中藥材資源異常豐富，素有“華中藥庫(kù)”之稱，是皺皮木瓜的主產(chǎn)區(qū)之一。本地皺皮木瓜資源豐富，冠以“資丘木瓜”而暢銷全國(guó)，但皺皮木瓜的主要成分不明確，生產(chǎn)技術(shù)不規(guī)范，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多樣化，導(dǎo)致附加值不高，嚴(yán)重影響了資源的開(kāi)發(fā)與利用。

本文以恩施巴東當(dāng)?shù)貛讉€(gè)不同時(shí)期的皺皮木瓜果實(shí)為研究材料，通過(guò)形態(tài)學(xué)測(cè)量和HPLC法來(lái)測(cè)定皺皮木瓜中的齊墩果酸、熊果酸、原兒茶酸和綠原酸的含量，進(jìn)而探明皺皮木瓜中生長(zhǎng)過(guò)程中主要成分的變化規(guī)律，從而為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民皺皮木瓜的采收提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采集于湖北巴東縣野三關(guān)皺皮木瓜種質(zhì)基地，采集同一種植條件下的三顆果樹(shù)，每個(gè)果樹(shù)隨機(jī)采取3個(gè)果實(shí)，共采9個(gè)果實(shí)。采種時(shí)間從5.20號(hào)開(kāi)始，每隔十天采集一次，共采集七次，涵蓋果實(shí)的整個(gè)生長(zhǎng)周期，分別記為生長(zhǎng)期1、2、3、4、5、6、7，每次采集后注明批次、時(shí)間，然后立即用保鮮袋封好，于4℃冰箱中存放。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)量

從冰箱選取各生長(zhǎng)期的皺皮木瓜果實(shí)，每個(gè)生長(zhǎng)期選取大小一致、形態(tài)良好的果實(shí)，共3個(gè)，然后用游標(biāo)卡尺測(cè)量果實(shí)的縱徑、橫徑，依次測(cè)完七個(gè)生長(zhǎng)期，記錄數(shù)據(jù)，取平均值。果實(shí)的鮮重測(cè)定也選取大小一致、形態(tài)良好的果實(shí)，一共3組，用電子天平稱重，記錄數(shù)據(jù)，取平均值。

1.2.2樣品制備

首先將每個(gè)生長(zhǎng)期的皺皮木瓜果實(shí)進(jìn)行干燥，用粉碎機(jī)粉碎，然后80目篩子篩去，保存待用。本文采用浸提法提取，每個(gè)時(shí)期的果實(shí)粉末稱取5g，置入帶有瓶蓋的廣口瓶中，加上25ml的甲醇，用封口膜封好，并靜置12個(gè)小時(shí)進(jìn)行提取，提取結(jié)束后，用濾紙進(jìn)行粗過(guò)濾，去除固體物質(zhì)，然后將剩下的提取液倒入到25ml的容量瓶中進(jìn)行定容，再用1.5L的注射器吸取每個(gè)時(shí)期的提取液，0.45μm微孔過(guò)濾，注入1.5mlHPLC進(jìn)樣管中，編號(hào)后低溫待測(cè)。

1.2.3 高效液相色譜條件

齊墩果酸和熊果酸測(cè)定參照用2015版中國(guó)藥典木瓜的方法。流動(dòng)相：甲醇-水-冰乙酸-三乙胺（265∶35∶0.1∶0.05）;檢測(cè)波長(zhǎng)為：210nm ;體積流量：1.0mL/1nin;進(jìn)樣量：20μL;柱溫：16～18℃。

綠原酸和原兒茶酸參照李超[9]的測(cè)定方法測(cè)定。流動(dòng)相： A相為乙腈， B相為0.1%磷酸水溶液;檢測(cè)波長(zhǎng)：原兒茶酸260 nm，綠原酸333nm;體積流量：1.0 mL/min ? ?柱溫： 40 ℃ ;進(jìn)樣量： 5 μL;梯度洗脫， 0～15 min， 9%～12% A; 15～16 min，12%～18% A; 16～30 min， 18%～20% A。色譜柱：AgilentC（4.6mm×250mm，5μm）

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取齊墩果酸和熊果酸各6mg的混合對(duì)照品，在容量瓶中用甲醇溶解并定容至10ml，搖勻，制成濃度為6ml/ml的對(duì)照品混合母液，后以2倍、4倍、8倍、10倍、16倍的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，濃度分別為3ml/ml、1.5ml/ml、0.75ml/ml、0.6ml/ml和0.375ml/ml;再分別稱取原兒茶酸5.33mg、綠原酸7.65mg的對(duì)照品，用甲醇溶解于并定容于10ml的容量瓶中，制得原兒茶酸母液0.533 ml/ml、綠原酸0.765 ml/ml的母液，再以10、20、40、60倍數(shù)進(jìn)行稀釋。最后，將稀釋后的各對(duì)照品溶液用注射器進(jìn)行0.45μm微孔過(guò)濾，注入HPLC進(jìn)樣瓶，編號(hào)待測(cè)。按照1.2.3的色譜條件在高效液相色譜儀進(jìn)樣，從中得出各樣品的峰面積，以濃度為X軸，峰面積為Y軸，在Excel中生成線性回歸方程，回歸方程如表1.1所示。

1.2.6 樣品含量測(cè)定

操作高效液相色譜儀，每次進(jìn)樣前都需清洗色譜柱和進(jìn)樣針，將待測(cè)的的樣品溶液準(zhǔn)備好，按照1.2.3的色譜條件調(diào)節(jié)色譜儀，用進(jìn)樣針吸取規(guī)定量的樣品到高效液相色譜儀中便開(kāi)始跑樣，之后得出各樣品的峰面積，將各樣品峰面積代入相對(duì)應(yīng)的回歸方程，算得出濃度，進(jìn)而計(jì)算出各個(gè)時(shí)期齊墩果、熊果酸、原兒茶酸和綠原酸的質(zhì)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析。差異顯著性檢驗(yàn)采用LSD、鄧肯法。

2.結(jié)果與分析

2.1皺皮木瓜形態(tài)學(xué)特征的動(dòng)態(tài)變化

2.1.1果實(shí)發(fā)育過(guò)程顏色變化

根據(jù)各個(gè)采收期的觀察，皺皮木瓜木瓜的顏色變化為生長(zhǎng)期1、生長(zhǎng)期2、生長(zhǎng)期3、生長(zhǎng)期4的木瓜顏色呈現(xiàn)出綠色，生長(zhǎng)期5顏色開(kāi)始變成黃綠色，生長(zhǎng)期6和生長(zhǎng)期7黃綠色逐漸加深。

2.1.2 皺皮木瓜縱橫徑的動(dòng)態(tài)變化

如圖2.1所示，皺皮木瓜的縱徑、橫徑都表現(xiàn)為正向增加，兩者增長(zhǎng)趨勢(shì)類似，在果實(shí)發(fā)育前期（采收期1、2、3）縱橫徑的增加迅速，縱徑平均增加1.87cm，橫徑平均增加1.48cm，隨著果實(shí)的不斷發(fā)育，果實(shí)發(fā)育中期（采收期4、5）果實(shí)增長(zhǎng)速率有所下降，縱徑平均增加0.65cm，橫徑平均增加0.82cm，果實(shí)接近成熟時(shí)，縱橫徑變化逐漸平穩(wěn)，此時(shí)果實(shí)的縱橫徑達(dá)到最大。

2.2 皺皮木瓜不同時(shí)期的鮮重變化

如圖2.2所示，皺皮木瓜果實(shí)質(zhì)量可以分為三個(gè)階段，第一個(gè)階段從采收期1到采收期期3，此時(shí)為果實(shí)的快速生長(zhǎng)期，果實(shí)質(zhì)量迅速增加，第二個(gè)階段為采收期3到采收期5，此時(shí)果實(shí)處于膨大階段，果實(shí)質(zhì)量增加較快，第三個(gè)階段為采收期5到果實(shí)成熟，果實(shí)鮮重的增長(zhǎng)速率較小，曲線變得平滑，此階段的果實(shí)鮮重最高。

2.3 皺皮木瓜不同時(shí)期主要成分的變化

2.3.1不同采收期齊墩果酸含量變化

如圖2.3所示，齊墩果酸的含量在不同生長(zhǎng)期有明顯差異，采收期1到采收期4齊墩果酸的含量隨著時(shí)間不斷上升，繼采收期4后齊墩果酸含量開(kāi)始緩慢下降，到采收期6時(shí)，齊墩果酸含量則和采收期3時(shí)的含量沒(méi)太大差異，在采收期6和采收期7的期間，齊墩果酸含量迅速上升，此時(shí)的齊墩果酸含量為果實(shí)發(fā)育期的最高值，整個(gè)生長(zhǎng)期齊墩果酸含量變化為增加-減少-增加。

2.3.2不同采收期熊果酸含量變化

如圖2.4所示，熊果酸的含量在整個(gè)果實(shí)生長(zhǎng)期間呈上升趨勢(shì)，采收期1到采收期3，其含量依次增加，采收期4含量與采收期3的無(wú)顯著差異，隨著果實(shí)的的成熟，熊果酸含量又不斷增加，采收期6到采收期7間，同齊墩果酸一樣迅、速增加，熊果酸的增加也主要在生長(zhǎng)期的后期。

2.3.3不同采收期原兒茶酸含量變化

如圖2.5所示，原兒茶酸含量變化分為四大個(gè)階段，果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育前期（采收期1）具有較高的含量，隨著時(shí)間變化，原兒茶酸含量降低（采收期2、采收期3），到了果實(shí)發(fā)育中期（采收期4）其含量又有所提高，在果實(shí)發(fā)育后期，原兒茶酸含量逐漸降低到最低值。隨著果實(shí)的不斷成熟，其原兒茶酸的含量呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢(shì)。

2.3.4不同采收期綠茶酸含量變化

如圖2.6所示，綠原酸的含量變化呈現(xiàn)出下降、上升最后再下降的趨勢(shì)。果實(shí)在生長(zhǎng)前期含有較高綠原酸含量，到在采收期2時(shí)含量急劇下降，采收期3和采收期4隨著時(shí)間變化緩慢上升，之后含量又不斷的下降。與原兒茶酸變化類似，隨著果實(shí)逐漸成熟，其綠原酸含量逐漸。

3 結(jié)論與討論

皺皮木瓜果實(shí)的縱徑、橫徑和鮮重在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都呈正向增加，呈現(xiàn)出S型增長(zhǎng)動(dòng)態(tài)曲線，其中5月20號(hào)到6月11號(hào)為皺皮木瓜果實(shí)的快速生長(zhǎng)階段，此階段皺皮木瓜果實(shí)的縱徑、橫徑及鮮重增長(zhǎng)速率最快，因此，在這個(gè)階段，生產(chǎn)上要加強(qiáng)肥水的管理，以保證良好的皺皮木瓜產(chǎn)量和品質(zhì)。

皺皮木瓜果實(shí)的齊墩果酸含量大體隨著果實(shí)的不斷發(fā)育而增加，但在6月20號(hào)時(shí)，其含量又有所下降，此情況還需進(jìn)一步研究，熊果酸含量在果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)為逐漸增加，成熟期時(shí)達(dá)到最大值，齊墩果酸和熊果酸含量的最大值都是在果實(shí)的成熟階段。原兒茶酸和綠原酸在5.20號(hào)發(fā)育初期是保持較高的含量，而隨著果實(shí)進(jìn)一步發(fā)育，其含量不斷下降，但在6.20號(hào)時(shí)，兩者含量又有所回升，其原因尚不清楚，綠原酸變化可能的原因是在這個(gè)階段是皺皮木瓜胚生長(zhǎng)和內(nèi)果皮、種核的變硬階段，即處于內(nèi)果皮、心皮及種核木質(zhì)化時(shí)期。綠原酸是用于合成內(nèi)果皮、種核木質(zhì)化結(jié)構(gòu)的成份[10]，所以果實(shí)需要綠原酸的量增大。因果實(shí)內(nèi)的綠原酸轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素，故含量降低。當(dāng)降到最低點(diǎn)后，內(nèi)果皮、種核已基本木質(zhì)化，此后綠原酸的需要量逐漸降低，故果實(shí)內(nèi)綠原酸含量逐漸回升。但為何之后的含量又不斷降低？這些情況都待進(jìn)一步研究。

針對(duì)皺皮木瓜不同采收期形態(tài)學(xué)指標(biāo)和主要成分分析，其最佳采收期根據(jù)不同生物量有所不同。第一種為6月下旬，此時(shí)原兒茶酸和綠原酸的生物量在整個(gè)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中最高。第二種采收期為7月下旬，此時(shí)果實(shí)已經(jīng)成熟，果實(shí)顏色為黃綠色，鮮重達(dá)到最高值，齊墩果酸、熊果酸含量最高，總體生物量最高，該結(jié)論與《中國(guó)藥典》[1]2015年版規(guī)定皺皮木瓜“為近成熟果實(shí)，夏、秋二季果實(shí)綠黃時(shí)采收”相一致，《中藥大辭典》[11]，《中華本草》亦描述為“7月到8月上旬木瓜外皮呈青黃色時(shí)采收”。 這一結(jié)論對(duì)于皺皮木瓜的采收具有一定的指導(dǎo)意義。

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