果王素對(duì)小鼠肺腺癌移植瘤NPM表達(dá)的調(diào)控及意義

鐘柏英 陳薈婷 賀立洋 魏文婕 賀兼斌

摘要：目的 觀察果王素對(duì)小鼠肺腺癌移植瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，檢測(cè)小鼠移植瘤腫瘤組織中NPM的表達(dá)，探討果王素抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移可能的機(jī)制。方法 構(gòu)建肺腺癌小鼠移植瘤模型，將32只接種Lewis肺腺癌細(xì)胞的C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量（60mg/kg）果王素組、中劑量（120mg/kg）果王素組和高劑量（240mg/kg）果王素組，每組8只。接種后第4天起，予以相應(yīng)藥物干預(yù)，第24天處死小鼠，分離移植瘤稱瘤體質(zhì)量，計(jì)算轉(zhuǎn)移抑制率與腫瘤抑制率，剖胸取肺組織觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，免疫組化法檢測(cè)小鼠皮下移植腫瘤細(xì)胞中NPM的表達(dá)水平。結(jié)果 果王素組小鼠皮下移植瘤的生長速度、體積、質(zhì)量和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)較對(duì)照組明顯降低，而腫瘤抑制率和肺轉(zhuǎn)移抑制率顯著升高，皮下移植瘤中NPM蛋白表達(dá)水平下降。而且果王素的濃度越高，上述指標(biāo)差異越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 果王素對(duì)小鼠肺腺癌移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制NPM過表達(dá)，抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞： 果王素 小鼠 NPM 肺腺癌 轉(zhuǎn)移瘤

【中圖分類號(hào)】R734.2 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ?【文章編號(hào)】1673-9026（2021）09-013-02

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，也是我國死亡率上升最快的癌癥， [1-2]。肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌占80%-85%，肺腺癌最常見的非小細(xì)胞肺癌，大部分患者確診時(shí)已為中晚期，喪失手術(shù)治療機(jī)會(huì)[3]，放化療為該類患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但近年來其療效已達(dá)到瓶頸，且副作用嚴(yán)重 [4]。因此尋找高效、低毒的天然藥物抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是今后抗腫瘤的新策略之一。果王素（獼猴桃果仁油脂肪酸）具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[5]。課題組前期研究表明[6-7]，果王素能有效抑制小鼠肺腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。但其具體的抗腫瘤機(jī)制尚不太明確。NPM（核仁磷酸蛋白）是一種核仁蛋白，在細(xì)胞增殖和生長中發(fā)揮重要作用[8-9]。有研究表明[10-13]，NPM在多種腫瘤組織中過表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤發(fā)展階段呈正相關(guān)。本研究通過構(gòu)建肺腺癌小鼠移植瘤模型，予以不同劑量的果王素進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)肺腺癌小鼠移植瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，并檢測(cè)腫瘤組織中NPM蛋白表達(dá)水平，探索其抗腫瘤的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ?Lewis肺腺癌荷瘤種鼠（鼠源）2只，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。C57BL/6J 小鼠32只，雄性，體重（20±2）g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，（許可證號(hào)：SYXK[京]2019-0019）。

1.1.2 藥品及試劑 果王素購于湘西老爹生物有限公司，為黃色油性液體，中華獼猴桃果仁非飽和脂肪酸含量為600 g/L。兔抗鼠Nucleophosmin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒、DAB顯色劑由福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供。

1.2 ?動(dòng)物模型的建立 ?處死Lewis 肺腺癌荷瘤種鼠，無菌條件下剝離腫瘤并去掉表面結(jié)締組織、血管以及內(nèi)部壞死組織，按1 g腫瘤組織加4ml 0.9% 氯化鈉溶液的比例在表面皿中剪碎，置入勻漿機(jī)中研磨成勻漿液，用孔徑 0.042 mm的360 目鋼網(wǎng)濾過，制成腫瘤細(xì)胞懸液，倒入離心管，加入0.9% 氯化鈉溶液，顯微鏡下將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)為 2×106 個(gè) /mL，在每只C57BL/6J 小鼠右后腿根部外側(cè)皮下注射 0.2 mL 的腫瘤細(xì)胞懸液，建立肺腺癌小鼠皮下移植瘤模型。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及用藥 ?所有小鼠接種腫瘤細(xì)胞后第4天，皮下移植處均見小結(jié)節(jié)樣腫瘤生長，開始予以藥物干預(yù)。按隨機(jī)數(shù)字表法將32只小鼠分為4組，每組8只，對(duì)照組、低劑量（60mg/kg）果王素處理組、中劑量（120mg/kg）果王素處理組和高劑量（240mg/kg）果王素處理組，劑量依據(jù)課題組前期工作及相關(guān)文獻(xiàn)而定[6-7]。對(duì)照組小鼠給0.9% 氯化鈉溶液0.3 mL灌胃，果王素處理組小鼠分別以0.3ml用0.9% 氯化鈉溶液稀釋（60、120、240）mg/kg果王素的液體灌胃，每天一次。腫瘤接種后第24天處死全部小鼠，取出皮下移植瘤，固定于4%中性甲醛溶液，后包埋于石蠟，以供免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)。剖胸取雙肺組織置入Boins液固定，用以觀察肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。

1.4 觀察指標(biāo)和方法

1.4.1 腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的觀測(cè) ? 小鼠接種腫瘤細(xì)胞第4天起，每3天測(cè)量皮下移植瘤最大長徑a和短徑b一次，計(jì)算腫瘤體，腫瘤平均體積=0.52a×b2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分離移植瘤，稱腫瘤重量，計(jì)算腫瘤抑制率（%）=（1-果王素處理組瘤體質(zhì)量/對(duì)照組瘤體質(zhì)量）×100%。剖胸取雙肺組織，置入Boins液處理后，對(duì)肺表面的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)，計(jì)算肺轉(zhuǎn)移抑制率（%）=（1-果王素處理組平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)/對(duì)照組平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)）×100%。

1.4.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) ? 用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)NPM的表達(dá)，方法及步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，一抗為兔抗鼠Nucleophosmin單克隆抗體，抗體按1：100稀釋，用PBS緩沖液替代一抗為陰性對(duì)照。NPM染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核中出現(xiàn)清晰棕黃色或棕褐色顆粒清晰為陽性。采用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定腫瘤組織中NPM的平均灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ? 應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，定量數(shù)據(jù)以 表示，采用X2檢驗(yàn)、單因素方差分析、q檢驗(yàn)分別比較率、多組間均數(shù)、兩兩間均數(shù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1果王素抑制小鼠移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移

接種腫瘤細(xì)胞后，皮下移植處成瘤率100.0%，接種后的前4天，各組小鼠皮下移植瘤大小無明顯差異，后逐漸增大，局部呈結(jié)節(jié)狀，接種第18～24天后，各劑量果王素處理組小鼠皮下移植瘤生長明顯慢于對(duì)照組，且高劑量果王素組腫瘤生長最，接種腫瘤細(xì)胞后第24天，各組小鼠均存活。處死小鼠后解剖觀察見各劑量果王素處理組對(duì)皮下移植瘤生長及腫瘤肺轉(zhuǎn)移均有明顯抑制作用（圖 1、2）。與對(duì)照組相比，各劑量果王素處理組皮下腫瘤的體積、質(zhì)量和肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均明顯降低（P<0.05， P<0.01），而腫瘤抑制率和肺表面結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率均明顯升高（P<0.05， P<0.01），與低果王素處理組比較，中高果王素處理組上述指標(biāo)顯著改善（P<0.05， P<0.01），而且，高果王素處理組上述指標(biāo)較中果王素處理組改善更明顯（P<0.05），表 1。

2.2果王素下調(diào)小鼠皮下移植瘤中NPM蛋白的表達(dá)

NPM蛋白表達(dá)與腫瘤細(xì)胞胞核中，出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。對(duì)照組出現(xiàn)較多NPM陽性細(xì)胞，低、中、高劑量果王素處理組均仍有少量陽性細(xì)胞，而且隨著果王素劑量升高，NPM表達(dá)依次減少，各組之間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，圖3）。

3、討論

肺癌惡性程度高，易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。肺癌的發(fā)生發(fā)展受多因素影響，與多種癌基因過度表達(dá)及抑癌基因的失活密切相關(guān)。近年來，靶向治療開創(chuàng)了肺癌治療新時(shí)代。果王素為獼猴桃果仁靜臨界CO2萃取法提取的果仁油，主要成分為a-亞麻酸，含有一定量的維生索E及微量元素硒等物質(zhì)，具有抗癌和保護(hù)正常組織細(xì)胞活性的作用。課題組前期研究表明[6-7，14]，果王素度肺腺癌的生長與轉(zhuǎn)移有較好的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，各劑量果王素組小鼠肺腺癌皮下移植瘤的生長速度、質(zhì)量和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯降低，而腫瘤抑制率和肺轉(zhuǎn)移抑制率則明顯升高，并且隨著果王素處理劑量的效果越顯著，各組間相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明果王素能明顯抑制肺腺癌移植瘤的生長與轉(zhuǎn)移，且呈劑量依賴性。

另外，本研究通過檢查小鼠肺腺癌移植瘤內(nèi)NPM的表達(dá)情況，為了進(jìn)一步探討果王素是否通過調(diào)控NPM表達(dá)發(fā)揮抑制肺腺癌的生長與轉(zhuǎn)移作用。NPM是主要的核仁磷酸化蛋白，能在核仁、核質(zhì)核胞質(zhì)之間穿梭，具有多種功能，不僅與核糖體生物合成[15]、DNA復(fù)制和修復(fù)[16]、調(diào)節(jié)抑癌基因p53和p14的活性[17]、作為分子伴侶阻止蛋白集聚等過程密切相關(guān)，而且參與監(jiān)控核仁活性及細(xì)胞增殖。本研究中，對(duì)照組中NPM蛋白呈高表達(dá)，而果王素理組NPM蛋白的表達(dá)及平均灰度值隨劑量遞增依次降低，且高劑量果王素處理組下降最明顯。結(jié)果表明，果王素可能通過抑制腫瘤組織中NPM蛋白過表達(dá)發(fā)揮抑制肺腺癌生長和轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，果王素能明顯抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能與抑制NPM蛋白的過表達(dá)有關(guān)。NPM在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起癌基因作用，有可能成為肺癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)。但肺癌的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，果王素抑制肺癌生長和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)理仍有待更更一步探索。

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作者簡介：鐘柏英（1985-09），女，漢族，湖南省臨武縣，南華大學(xué)附屬懷化醫(yī)院，主治醫(yī)生，研究生在讀，臨床醫(yī)學(xué)腫瘤方向。通訊作者：賀兼斌