不同模式表面等離子體共振與其他分析檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用

趙 欣， 王瑞敏， 康 青*， 汪鵬程， 周飛艨*

(表面分析與化學(xué)生物學(xué)研究院，濟(jì)南大學(xué)，山東濟(jì)南 250022)

1 引言

表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)是發(fā)生在金屬與介質(zhì)界面的一種光學(xué)現(xiàn)象。當(dāng)一束光以大于臨界角從光密介質(zhì)傳播到光疏介質(zhì)時(shí)，在界面的全反射使本應(yīng)折射的光束返回光密介質(zhì)。而實(shí)際上有部分入射光會(huì)滲透到光疏介質(zhì)中，平行于界面?zhèn)鞑?消逝波)。消逝波在光疏介質(zhì)中傳播一段距離會(huì)再回到光密介質(zhì)，而當(dāng)消逝波的頻率與金屬表面振蕩的自由電子(即等離子)頻率一致時(shí)，等離子將吸收入射光的大部分能量發(fā)生共振，使反射光能量減少直至完全消失，這時(shí)的入射角稱為共振角(SPR角)。SPR角隨金屬表面的折射率變化而產(chǎn)生變化。因?yàn)樵诒砻娴姆肿游侥軐?dǎo)致質(zhì)量變化而引起折射率的變化，所以共振角的移動(dòng)、反射光強(qiáng)度的變化和調(diào)制的相位均可用來獲得分子吸附過程和分子間結(jié)合的定量信息。由于所有物質(zhì)均有折射率，因此SPR技術(shù)具有免標(biāo)記和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[1]。近年來SPR技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展，SPR與其他檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)用可結(jié)合多種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，中科院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所的牛利教授課題組、北京大學(xué)的劉虎威教授課題組、南京大學(xué)的王偉教授課題組等已分別對(duì)SPR-電化學(xué)[2]、SPR-質(zhì)譜[3]、SPR顯微鏡成像[4]技術(shù)特征進(jìn)行了詳盡的概括和總結(jié)。但據(jù)我們所知，尚未有比較SPR三種模式(常規(guī)SPR，成像SPR，SPR顯微鏡技術(shù))的同異性和應(yīng)用體系的綜述。鑒于趙藻藩先生在分析化學(xué)尤其是電分析化學(xué)方面的卓越成就，作為紀(jì)念論文之一的本文著重在三種模式的分析技術(shù)特性(Analytical Figures of Merit)和其與多通道流通體系，和以電化學(xué)為代表的其他檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)用方面的工作進(jìn)行介紹。

圖1A所示的常用SPR裝置是Kretschman結(jié)構(gòu)。當(dāng)樣品流經(jīng)芯片表面時(shí)，樣品中的待測(cè)物會(huì)與芯片表面的預(yù)先固定的配體發(fā)生特異性結(jié)合，使傳感芯片表面折射率隨時(shí)間變化，從而產(chǎn)生SPR傳感譜圖(Sensorgram)。通過對(duì)傳感譜圖的模擬和分析準(zhǔn)確得到分子結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)的數(shù)據(jù)[5]。由于免標(biāo)記，受配體的結(jié)構(gòu)及其之間的結(jié)合不受影響，SPR[6]和等溫滴定量熱法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC[7])已成為測(cè)量分子間親和力等熱力學(xué)參數(shù)的最佳手段，且SPR還能獲得動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)。

鑒于常規(guī)SPR模式無法進(jìn)行高通量分析，蛋白質(zhì)/核苷酸陣列和SPR技術(shù)結(jié)合催生了SPR成像技術(shù)(Surface Plasmon Resonance imaging,SPRi)。與常規(guī)SPR必須先后分析多種待測(cè)物不同的是：SPRi可同時(shí)記錄微陣列芯片上每個(gè)陣列點(diǎn)產(chǎn)生的傳感譜圖[5,8]，因此可以對(duì)復(fù)雜樣品中的多個(gè)待測(cè)物予以高通量分析，大大節(jié)省了分析時(shí)間和樣品量[9]。圖1B所示的SPRi模式中，通過棱鏡放大的入射光束覆蓋芯片上預(yù)先打印的各陣列點(diǎn)，反射光被CCD相機(jī)捕獲而成像[5]。由于常規(guī)SPR可以在無需移動(dòng)光學(xué)部件的前提下通過對(duì)共振角的移動(dòng)和改變反射光強(qiáng)度[5,10]得到傳感譜圖，因此噪音小，信噪比好于SPRi。尤其通過相位調(diào)制[11]和局域化SPR(Localized SPR)[12]，靈敏度還可提升至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。

SPRi使用的三角棱鏡會(huì)將擴(kuò)大的光斑扭曲為橢圓型，且SPRi成像儀空間分辨率(100 μm[13])不高，因此SPR顯微鏡成像(Surface Plasmon Resonance Microscopy,SPRM)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[14,15]。如圖1C所示，SPR與倒置顯微鏡相結(jié)合，大大提高了分辨率[4]。同時(shí)利用倒置顯微鏡自帶的光源獲得SPRM感應(yīng)區(qū)的明場(chǎng)圖像，SPR圖像的每個(gè)像素處均可產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的傳感譜圖，空間分辨率高達(dá)～1 μm。因此可用于可視化研究，如細(xì)菌、細(xì)胞、病毒、囊泡以及納米粒子等[4]。特別是對(duì)細(xì)胞膜蛋白分子與配體或藥物的相互作用的研究，使常規(guī)SPR以及SPRi只能望其項(xiàng)背[4]。但SPRM作為一種新技術(shù)，還有很多基礎(chǔ)問題和現(xiàn)象需要研究，與常規(guī)SPR以及SPRi相比，在通量和相互作用動(dòng)力學(xué)研究數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性上尚待完善。

圖1 SPR的三種模式。(A)常規(guī)SPR[1],示意圖中的三角棱鏡常以半圓棱鏡取代，且包括對(duì)共振角的移動(dòng)和反射光強(qiáng)度變化或相位調(diào)制予以鎖相放大等檢測(cè)方法；(B)SPRi[5]；(C)SPRM。(D)SK-BR3細(xì)胞的SPRM圖像[16]。(E)SK-BR3細(xì)胞的典型SPR傳感譜圖[16]。Fig.1 The three modes of SPR.(A) A conventional SPR system[1],the triangular prism shown in this representative diagram is commonly replaced by a hemispherical prism and the detection mechanism includes the measurements of the SPR resonance angle and the intensity of the reflected light near the angle and monitoring the phase shift of modulated light by a lock-in amplifier;(B) An SPR imaging system[5];(C) SPR microscopy.(D) A typical SPR image of SK-BR3 cells [16].(E) The SPR sensorgrams of SK-BR3 cells [16].

表1對(duì)比了三種SPR模式的技術(shù)特征。三種SPR模式的測(cè)量對(duì)象和應(yīng)用范圍不盡相同，因此在生物分析、生物物理和化學(xué)生物學(xué)、藥物研發(fā)中扮演不同的角色，可說是取長(zhǎng)補(bǔ)短，相得益彰。因此三種模式均已有商品化的儀器。

表1 SPR、SPRi、SPRM模式的技術(shù)特征和應(yīng)用對(duì)象比較[17-20]Table 1 Comparison of the figures of merit and applications among SPR,SPRi and SPRM[17-20]

(續(xù)表1)

2 SPR聯(lián)用技術(shù)

近年來，常規(guī)SPR傳感己趨于成熟，因此SPR技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用成為研究熱點(diǎn)。聯(lián)用技術(shù)可彌補(bǔ)SPR不能鑒定分子結(jié)構(gòu)和消除表面存在一些干擾等的不足，并能進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性。

2.1 與微流控和多種流動(dòng)注射系統(tǒng)的聯(lián)用

微通道流通系統(tǒng)是SPR生物傳感測(cè)量的一個(gè)關(guān)鍵部分，其控制精度不僅與獲取的數(shù)據(jù)的可靠性相關(guān)，也決定了耗樣量和傳質(zhì)速率大小等因素。細(xì)窄的SPR流通池通道一般通過微加工實(shí)現(xiàn)，樣品的遞送可通過微流控裝置或流動(dòng)注射分析系統(tǒng)控制。早期基于常規(guī)SPR模式的流通池為雙通道(其中之一作為參比通道用于扣除背景信號(hào))，為獲得多個(gè)傳感譜圖需要將不同濃度的待測(cè)物先后注入配體覆蓋的分析通道中，且每一次分析后必須對(duì)傳感芯片予以再生。近年來開發(fā)出的多通道系統(tǒng)不僅提高了通量，改變了傳統(tǒng)的分析流程，還可以靈活地控制不同的通道的開啟與關(guān)閉而進(jìn)行雙通道SPR無法實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)。如本課題組通過有序地關(guān)閉流通池的五個(gè)通道，只需要注射一次配體溶液即可在五通道SPR儀中的四個(gè)流通通道中固定不同密度的配體(圖2A)。然后一次注射待測(cè)分子即可同時(shí)得到扣除第五通道背景后的四條不同傳感曲線(圖2B)。該方法流程簡(jiǎn)單，避免了芯片再生的篩選和優(yōu)化，從而降低了樣品和芯片的消耗[21]。我們還開發(fā)了一種雙閥進(jìn)樣流通體系，提高了生物識(shí)別分子固定量和免再生SPR檢測(cè)的靈敏度[26]。該方法可以實(shí)現(xiàn)一種或多種樣品以串聯(lián)或并聯(lián)方式進(jìn)樣。這種交替注射模式不僅節(jié)省進(jìn)樣時(shí)間，還能高效簡(jiǎn)便地固定配體，防止待測(cè)物的解離。這種檢測(cè)方法同樣避免了常規(guī)方法對(duì)生物復(fù)合物重復(fù)解離而再生芯片的步驟，并將SPR拓寬到了由于芯片再生而導(dǎo)致蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)無法恢復(fù)的體系的研究中。

微流控技術(shù)可以組建更多的通道、進(jìn)樣接口、平行排布相同的結(jié)構(gòu)單元[27 - 30]，因此微流控技術(shù)與SPR聯(lián)用可以更大地提高檢測(cè)通量[28,30,31]和減少樣品消耗。例如日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所的Kurita課題組采用微流控多通道SPR圖像識(shí)別技術(shù)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行了評(píng)估[22]。他們用聚二甲硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)原料制備了流通池，在SPR芯片上修飾五種不同結(jié)構(gòu)的半胱氨酸衍生物。獲取了正常細(xì)胞和4種癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中細(xì)胞代謝物與不同的半胱氨酸衍生物相互作用產(chǎn)生SPR傳感響應(yīng)圖樣(圖2C、2D)。該方法所設(shè)計(jì)的多通道微流控體系消耗樣品少(～25 μL)且測(cè)量快捷(10 min)，所獲得的信息全面且不依賴特定的生物標(biāo)記物。這種細(xì)胞無損傷的圖像識(shí)別方法有望成為表征細(xì)胞的通用工具。此外美國斯坦福大學(xué)的Demirci課題組開發(fā)了一種便攜式、免標(biāo)記的病原體檢測(cè)平臺(tái)[32]。該平臺(tái)整合了微流控和SPR技術(shù)，顯示了對(duì)細(xì)菌病原體(如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)定量檢測(cè)的能力，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)法(如酶聯(lián)免疫法和聚合酶鏈反應(yīng))耗時(shí)長(zhǎng)的不足，有望推廣到其他病原體檢測(cè)或用于臨床診斷中。另外，微流控連續(xù)進(jìn)樣通過PDMS模具(圖2E)一次性制備微陣列芯片可用于G蛋白及對(duì)應(yīng)抗體的SPRi檢測(cè)[23]。該技術(shù)可以在芯片表面來回進(jìn)樣孵育，增加了固定密度、減少了樣品消耗、縮小了傳統(tǒng)點(diǎn)樣針打點(diǎn)造成的點(diǎn)間差異，提高了檢測(cè)通量。近期96通道的微流控進(jìn)樣器配合96點(diǎn)的微陣列芯片，可以自動(dòng)檢測(cè)9216(96×96)次分子間的相互作用[33]。類似的微陣列芯片也被應(yīng)用于新冠病毒抗體的檢測(cè)。通過注射不同類型的免疫球蛋白抗體(anti-IgA，anti-IgG和anti-IgM),新冠病人血清在微陣列芯片上會(huì)產(chǎn)生不同的響應(yīng)信號(hào)(圖2F),可以對(duì)病人血清中各類免疫球蛋白進(jìn)行定量分析[24]。Rinat-Pfizer公司推出了一種運(yùn)用水平和垂直雙向微流控裝置制備微陣列芯片的方法(圖2G)[25]。在水平方向注射待測(cè)物，垂直方向注射配體。在不同通道不同位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了不同待測(cè)物活化固定，并以此分析了36種IgG與15種生物肽的相互作用[25]。

圖2 (A)通過自下而上先后關(guān)閉通道來固定不同量的前列腺特異性抗原(PSA)抗體(彎曲箭頭表示溶液流動(dòng)方向；褐點(diǎn)為控制通道關(guān)閉和打開的端口[21])。(B)往預(yù)先固定了0.078、0.148、0.268和0.458 ng·mm-2 牛血清蛋白(BSA)的通道中單次注射300 nmol·L-1 BSA抗體[21]。(C)固定有半胱氨酸衍生物的多通道SPR芯片的照片[22]。(D) 由半胱氨酸衍生物和不同組分的細(xì)胞培養(yǎng)基之間的交叉反應(yīng)產(chǎn)生的SPR響應(yīng)信號(hào)[22]。(E)聚二甲硅氧烷微流控打印模型。每個(gè)點(diǎn)孔有兩個(gè)微孔，通過微流控連續(xù)注射控制待測(cè)物的固定[23]。(F)SPRi微陣列檢測(cè)血清中新冠病毒抗體含量。通過不同點(diǎn)對(duì)應(yīng)的血清與免疫球蛋白抗體產(chǎn)生的信號(hào)，定量各類免疫球蛋白含量[24]。(G)雙向微流控制備微陣列芯片示意圖[25]。Fig.2 (A) Immobilization of bovine serum albumin onto different fluidic channels via sequential closures of the channels from downstream up.The direction of the solution flow is shown by the curved arrows and the ports for channel closure and opening are denoted by the brown dots [21].(B) A single injection of 300 nmol·L-1 anti-BSA antibody into channels pre-immobilized with 0.078,0.148,0.268,and 0.458 ng·mm-2 BSA[21].(C) A photograph of the cysteine derivative-covered multichannel SPR chip for pattern-recognition-based cell sensing [22].(D) SPR response patterns resulting from cross-reactive interactions between cysteine derivatives and cell culture media with different components[22].(E) A polydimethylsiloxane(PDMS) microfluidic printer[23].(F) Anti-SARS-CoV-2 immune globulins SPRi assay.The process of spotting sera samples to a RBD-coupled surface and its resultant SPRi reflectivity image [24].(G) Schematics of the dual-directional microfluidic method as an array biosensor[25].

電化學(xué)技術(shù)可以研究物質(zhì)伴隨電子轉(zhuǎn)移在表面的吸脫附或是表面吸附物的氧化還原過程[2]。電分析雖然可以靈敏地測(cè)量單分子或亞單分子層吸附物，但伏安曲線易受充電電流和復(fù)雜體系中多峰重疊現(xiàn)象等因素的干擾。雖然各種光譜電化學(xué)方法可以提供很多結(jié)構(gòu)方面的信息，但對(duì)吸/脫附物的定量往往求助于如石英晶體微天平(QCM)等能測(cè)量質(zhì)量變化的技術(shù)。如前所述，SPR測(cè)得的折射率的變化其實(shí)與質(zhì)量變化定量相關(guān)[2,6]。因此，SPR也是一個(gè)質(zhì)量檢測(cè)器，且靈敏度高于QCM。比如基于10 MHz 的晶振的靈敏度為5 ng·cm-2[36],而SPR的靈敏度高達(dá)0.01～0.1 ng·cm-2。因此電化學(xué)SPR(EC-SPR)已有較長(zhǎng)的研究和應(yīng)用歷史。本文主要針對(duì)電化學(xué)與三種SPR模式聯(lián)用的案例和數(shù)據(jù)解讀需要考慮的因素進(jìn)行探討。

EC-SPR技術(shù)已發(fā)展到多個(gè)領(lǐng)域，如痕量檢測(cè)[37,38]、表面吸脫附過程[39]、電聚合反應(yīng)過程[40 - 42]、電極反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定[43]、生物分子間相互作用[44]以及生物傳感[45,46]。循環(huán)伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)與SPR技術(shù)聯(lián)用可靈敏地測(cè)量氧化還原過程中吸附物的質(zhì)量，甚至是表面固定的生物分子構(gòu)型的細(xì)微變化。和QCM測(cè)得的質(zhì)量變化必須考慮吸附物的粘彈性和傳感器的靈敏度分布[36]一樣，EC-SPR 需要考慮測(cè)得的共振角變化(Δq)由于吸附層厚度(Δd)和電荷密度(Δs)的變化產(chǎn)生的信號(hào)：

Δq=c1Δd+c2Δn+c3Δs

(1)

其中，Δn為電極表面折射率變化，c1、c2和c3為系數(shù)。

在循環(huán)伏安過程中電極表面電荷密度s隨掃速v變化：

s=vCd[t-RsCd+RsCde-t/RsCd]/A

(2)

公式(2)中，Rs是溶液電阻，Cd是雙電層電容，A是電極面積。

因此循環(huán)伏安過程中雙電層的充電電流不斷變化會(huì)一直改變電極表面電荷密度，使得SPR信號(hào)的解析變得復(fù)雜。我們發(fā)現(xiàn)電位階躍法(Potential-step Chronoamperometry,PSC)比循環(huán)伏安法更適合與SPR聯(lián)用以精確測(cè)量電沉積薄膜的厚度[34]。

在PSC法中：

s=ECd[1 -e-t/RsCd]/A

(3)

根據(jù)估算，充電電流會(huì)在極短的時(shí)間內(nèi)(少于1 ms)達(dá)到穩(wěn)定值(ECd/A)，大大小于電沉積和電聚合等過程需要的成核時(shí)間。我們用PSC-SPR觀測(cè)到了成核步驟后二維擴(kuò)展成單層銅膜，以及三維生長(zhǎng)成聚苯胺的過程，而這一過程在僅用循環(huán)伏安或用循環(huán)伏安-SPR是不易觀察到的。當(dāng)雙電層充電電流減小后SPR測(cè)得的電聚合薄膜的厚度與原子力顯微鏡(AFM)測(cè)的十分吻合(圖3A、3B)。另外重慶大學(xué)的胡衛(wèi)華課題組采用PSC-SPR技術(shù)首次對(duì)電化學(xué)介導(dǎo)表面引發(fā)的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合過程進(jìn)行了原位現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[35]。圖3C為他們所用裝置圖，將含有CuBr2和聯(lián)吡啶、甲基丙烯酸縮水甘油酯和KCl溶液流過SPR檢測(cè)及參比通道，通過PSC法調(diào)控活化劑的比率來引發(fā)、控制、終止金膜表面聚合反應(yīng)過程(圖3D)。

圖3 (A)1.0 mmol·L-1苯胺溶液中電位從0.0 V階躍至0.7 V的q -t圖(插圖是在1.0 mmol·L-1苯胺+100 mmol·L-1 HClO4(黑色曲線)和100 mmol·L-1 HClO4(藍(lán)色曲線)溶液中用電位階躍從0.0至0.7 V獲得的計(jì)時(shí)電流圖[34]。(B)膜形成后Au/聚苯胺邊界的AFM圖像(底部的高度圖對(duì)應(yīng)于AFM圖像中白色線條部分[34])。(C)用于原位電化學(xué)介導(dǎo)表面引發(fā)的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合過程的EC-SPR設(shè)置[35]。(D)電位從開路電位步進(jìn)至0(a)、-0.03(b)、-0.06(c)、-0.10(d)和-0.15 V(e)時(shí)的SPR響應(yīng)(箭頭表示施加電位的時(shí)刻[35])。Fig.3 (A) q -t diagram upon a potential step from 0.0 to 0.7 V in 1.0 mmol·L-1 aniline(Inset is the chronoamperograms obtained from the potential step from 0.0 to 0.7 V in 1.0 mmol·L-1 aniline +100 mmol·L-1 HClO4(black curve) and in 100 mmol·L-1 HClO4(blue curve)[34]).(B) An AFM image of the Au/PAni boundary after the film formation(The cross-sectional contour at the bottom corresponds to the white line in the AFM image[34]).(C) Illustration of the EC-SPR Setup for in-situ electrochemically mediated surface-initiated atom transfer radical polymerization(eSI-ATRP) investigation [35].(D) Simultaneous SPR response for stepping the potential of a gold chip from the open-circuit potential to 0(a),-0.03(b),-0.06(c),-0.10(d),and -0.15 V(e)(The arrow indicates the moment when the potential was applied[35]).

早期電化學(xué)和SPRi的聯(lián)用主要是利用電化學(xué)方法制作陣列[49]，或利用施加的電場(chǎng)加快表面吸附過程[50]，但由于SPRi的局部成像分辨率不高，而靈敏度又低于常規(guī)SPR，因此EC-SPRi 此后并沒有得到更多的關(guān)注。近年來SPRM解決了SPRi成像不清晰和靈敏度的問題，且成像速度明顯快于掃描探針顯微技術(shù)(SPM，當(dāng)然對(duì)比于SPM納米區(qū)域的成像SPRM還是難以媲美)，因此SPRM和電化學(xué)結(jié)合的EC-SPRM具有獨(dú)特的應(yīng)用前景。與EC-SPR不同的是：EC-SPRM一方面可獲得電極或金屬膜不同部位的電化學(xué)過程的精細(xì)圖譜，另一方面又可以通過施加的電位或電流增強(qiáng)SPRM圖像的對(duì)比度。但EC-SPRM聯(lián)用技術(shù)也受雙電層充電電流[51]和表面過程[52]的影響。美國亞利桑那州立大學(xué)的陶農(nóng)建教授課題組將PSC與SPRM技術(shù)聯(lián)用，能夠在毫微秒響應(yīng)時(shí)間內(nèi)檢測(cè)微電極上的細(xì)胞色素c的氧化還原反應(yīng)和相對(duì)應(yīng)的構(gòu)象變化(圖4A)[47]。研究結(jié)果表明電子轉(zhuǎn)移過程中的構(gòu)象門控發(fā)生在從微秒到毫秒的較寬時(shí)間范圍內(nèi)(圖4B、4C)。另外，同一課題組還對(duì)單根金納米線(AuNW)的表面電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行了等離子成像研究[48]。若AuNW上發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，其SPR散射強(qiáng)度也會(huì)隨之發(fā)生變化，從而提供了單根AuNW的電化學(xué)信息。該設(shè)計(jì)消除了傳感層的干擾，同時(shí)保留了清晰的SPR響應(yīng)，首次獲得了單根AuNW的循環(huán)伏安圖。他們還研究了單根AuNW上不同位置的局域電化學(xué)反應(yīng)的差別(圖4E、4G)。

圖4 (A)具有超快光學(xué)檢測(cè)功能和小型化微電極的等離子體電化學(xué)顯微鏡(P-ECM)裝置圖[47]。在10 μs內(nèi)的氧化(B)和還原(C)過程中的P-ECM擬合數(shù)據(jù)。氧化過程中電極電位從-0.3 V階躍至+0.3 V；還原過程中電極電位從+0.3 V階躍至-0.3 V [47]。(D)等離子體電化學(xué)顯微鏡(P-ECM)實(shí)驗(yàn)裝置圖[48]。(E) 單根10 μm 金納米線(AuNW)的明場(chǎng)光學(xué)圖像[48]。(F)該AuNW在-0.2 V下對(duì)應(yīng)的P-ECM圖像。黑色虛線表示AuNW的位置[48]。(G)位于AuNW上標(biāo)為1,2兩個(gè)位點(diǎn)的等離子體CV 曲線(藍(lán)線和紅線)和多根AuNW的常規(guī)CV曲線(黑線)，電解質(zhì)為0.2 mol·L-1 NaOH，電位循環(huán)速率為0.2 V·s-1[48]。Fig.4 (A) Optical setup of plasmonics-based electrochemical microscopy(P-ECM) with ultrafast optical detection and miniaturized microelectrodes[47].P-ECM fitting data during oxidation(B) and reduction(C) over 10 μs.The electrode potential was stepped to +0.3 V from -0.3 V during oxidation,to -0.3 V from +0.3 V during reduction[47].(D) Experimental setup of plasmonics-based electrochemical microscopy(P-ECM).(E) Optical transmission image of a 10 μm AuNW[48].(F) A P-ECM image of the AuNW at -0.2 V.The black dashed line marks the location of the AuNW[48].(G) Plasmonic CVs from two locations on the AuNW(blue and red curves) and the conventional CV over a large ensemble of AuNW(black curve,and see also the inset).The electrolyte is 0.2 mol·L-1 NaOH,and the potential cycling rate is 0.2 V·s-1[48].

交流阻抗法 (Electrochemical Impedance Spectroscopy,EIS)[53]缺乏空間分辨率，一定程度上限制了其用于電化學(xué)過程的研究。陶農(nóng)建教授課題組將電化學(xué)阻抗與SPRM結(jié)合成為電化學(xué)阻抗等離子體成像技術(shù)(Plasmonic Imaging of Electrochemical Impedance,P-EIM)，用于研究電化學(xué)反應(yīng)[54]、分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)[55]、動(dòng)態(tài)檢測(cè)單細(xì)胞的凋亡和電穿孔過程中[56]。P-EIM的檢測(cè)利用金膜表面SPR效應(yīng)對(duì)表面電荷密度的高靈敏性，通過施加交流電測(cè)量相應(yīng)的SPR信號(hào)，并將直流和交流組件分別轉(zhuǎn)換為SPR和電化學(xué)阻抗顯微(Electrochemical Impedance Microscopy,EIM)圖像[57]。該SPR圖像對(duì)傳感表面質(zhì)量變化敏感，可測(cè)量細(xì)胞的質(zhì)量分布和動(dòng)力學(xué)，EIM圖像可提供細(xì)胞阻抗或電化學(xué)反應(yīng)的有關(guān)信息[56,57]。例如運(yùn)用P-EIM技術(shù)在亞細(xì)胞水平上對(duì)單個(gè)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏膯?dòng)和傳播進(jìn)行成像[58]。此技術(shù)所用的光學(xué)器件與傳統(tǒng)的膜片鉗和熒光顯微鏡兼容，從而可以使用多種技術(shù)研究同一樣品。因此該技術(shù)將有助于研究各種不同細(xì)胞中的電生理行為。

2.3 與其他技術(shù)聯(lián)用

由于SPR流通池可以和很便捷地與各種流動(dòng)體系結(jié)合，所以SPR已與高效液相色譜[59]、毛細(xì)管電泳[60]、各種質(zhì)譜(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization和Electrospray Ionization)[61,62]等聯(lián)用。與QCM聯(lián)用保留了SPR的對(duì)質(zhì)量變化的靈敏性，同時(shí)利用QCM技術(shù)提供薄膜厚度及粘彈性結(jié)構(gòu)等信息[63,64]。另外SPR和掃描電化學(xué)顯微鏡(Scanning Electrochemical Microscopy,SECM)[65]聯(lián)用可以研究電化學(xué)誘導(dǎo)的表面局部反應(yīng)。與熒光光譜[66,67]、紅外光譜[68]、橢圓偏振[69]等光學(xué)技術(shù)聯(lián)用也可以進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和分辨率，以獲取吸附物的結(jié)構(gòu)信息。

3 結(jié)論與展望

本文比較了三種SPR模式的分析技術(shù)特性、應(yīng)用范圍、各種流動(dòng)體系以及以電化學(xué)方法為代表的多種分析技術(shù)的聯(lián)用?；诔Ｒ?guī)模式的SPR商品化后經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)近40年的應(yīng)用和芯片開發(fā)，已成為免標(biāo)記研究分子間相互作用和藥物研發(fā)等方面不可或缺的一個(gè)分析技術(shù)，日臻成熟的SPRi則在高通量檢測(cè)和篩選以及組學(xué)研究方面鋒芒畢露，異軍突起的SPRM有望在針對(duì)單細(xì)胞膜蛋白為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)、細(xì)胞器的相關(guān)生物功能和活動(dòng)的研究、單個(gè)納米顆粒的結(jié)構(gòu)研究等方面發(fā)揮其獨(dú)特的作用。若要使SPRM的技術(shù)優(yōu)勢(shì)發(fā)揮得淋漓盡致，尚需進(jìn)一步對(duì)SPRM觀察的一些微納尺寸的界面和區(qū)域的現(xiàn)象進(jìn)行深入地基礎(chǔ)研究。至于SPR的在線聯(lián)用和原位觀察也好，離線使用也罷，只要是兩種和多種技術(shù)得當(dāng)?shù)貞?yīng)用在一個(gè)體系的研究中，往往能提煉出單一技術(shù)無法獲取的信息。而要做到和這三種SPR模式的珠聯(lián)璧合，就一定要了解乃至排除影響SPR信號(hào)變化的諸多因素，這些因素包括吸附分子的質(zhì)量和極化性(兩者均影響折射率)、吸附膜厚度、表面電荷、固/液界面和溶液溫度、機(jī)械振動(dòng)對(duì)光學(xué)系統(tǒng)的干擾等。一方面，其他技術(shù)既可提升SPR的技術(shù)特性和拓寬SPR技術(shù)應(yīng)用范圍；另一方面，SPR又可為其他技術(shù)提供一個(gè)實(shí)時(shí)、靈敏、免標(biāo)記的檢測(cè)手段。

隨著科技的快速發(fā)展，相信這三種SPR模式的性能將繼續(xù)提高，與其他檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)用也會(huì)更加多樣化。在人類還在繼續(xù)與各種病原體及其變種頑強(qiáng)斗爭(zhēng)的今天，能快速篩選各種疫苗、抗體、藥物的技術(shù)將備受青睞；同時(shí)，開發(fā)能滿足實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)臨床檢測(cè)需求的微型化便攜式儀器的努力還在繼續(xù)，SPR在這兩個(gè)方面都具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力。