防曬化妝品安全性體外方法探討

王婷梅 龍秋儀 李成 林錦雄 冉亞妮

摘 要：近年來，人們對(duì)防曬化妝品使用效果的要求逐漸增加，防曬產(chǎn)品中防曬劑由單一添加配方逐漸變成復(fù)配使用為主，那么，多種防曬劑的復(fù)合使用是否安全，會(huì)帶來哪些潛在風(fēng)險(xiǎn)，這是消費(fèi)者也是研究人員十分關(guān)注的問題。體外安全性評(píng)價(jià)法由于測(cè)試時(shí)間短，試驗(yàn)效率有所提高，同時(shí)避免了動(dòng)物試驗(yàn)成本高、周期長(zhǎng)、重復(fù)性差及人體安全等問題，所以現(xiàn)在各企業(yè)和研究人員會(huì)優(yōu)先考慮體外評(píng)價(jià)法。文章主要介紹通過3D皮膚模型刺激性試驗(yàn)、眼刺激試驗(yàn)等體外方法對(duì)防曬產(chǎn)品進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的原理。

關(guān)鍵詞：防曬產(chǎn)品;安全性評(píng)價(jià);體外方法;3D皮膚模型刺激性試驗(yàn);眼刺激試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R542.22 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-1064（2021）01-074-02

DOI：10.12310/j.issn.1674-1064.2021.01.032

隨著人們生活水平逐漸提高，具有美白、祛斑、抗氧化等功效的化妝品在人們?nèi)粘Ｉ钪械氖褂迷絹碓蕉啵罆窕瘖y品逐漸成為化妝品行業(yè)的重要產(chǎn)品之一。化妝品中加入防曬劑，是為了吸收或阻擋紫外線，使人體皮膚免受紫外線的損害。紫外線光譜有UVB、UVA、UVC三種。三者中，UVA和UVB對(duì)人體有直接危害;UVC的波長(zhǎng)最短，但其能量最高，由于大氣層的作用，幾乎沒有到達(dá)地球表面的概率。白天的日照光含有大量UVB，其大部分會(huì)被大氣層吸收，只有極少量能到達(dá)地球表面，長(zhǎng)時(shí)間照射會(huì)令皮膚產(chǎn)生黑色素，并會(huì)導(dǎo)致皮膚紅腫甚至蛻皮。白天的日照光中含有的UVA大部分能穿過大氣層到達(dá)地球表面，它對(duì)人體產(chǎn)生的危害是最大的，會(huì)破壞人體皮膚中的一些纖維組合物，對(duì)皮膚的傷害是累積且不可逆的。由此可見，人們對(duì)防曬化妝品的需求逐漸增加是非常必要的。

防曬化妝品是指隔絕或吸收陽光中的UVA和UVB，以防護(hù)人體皮膚免受或減少紫外線所引起的不良反應(yīng)為目的的化妝品。防曬化妝品中防曬劑的使用種類與使用量，不得超過規(guī)定要求的最大允許使用濃度，以確保防曬產(chǎn)品的使用安全性。

近年來，隨著消費(fèi)者對(duì)防曬化妝品提出的使用要求或使用效果的增多，防曬產(chǎn)品中防曬劑的使用種類由原本僅添加一種逐漸增加到三至五種，一些企業(yè)為了達(dá)到其宣稱的更好的防曬效果，添加的防曬劑種類甚至更多。目前來說，圍繞多種防曬劑一起使用是否有相互產(chǎn)生作用的研究還不多，那么多種防曬劑的復(fù)合使用是否安全，會(huì)帶來什么潛在風(fēng)險(xiǎn)，這也是消費(fèi)者和研究人員十分關(guān)注的問題。

目前，我國(guó)在安全性評(píng)價(jià)方面的方法有很多，其中，體外安全性評(píng)價(jià)法由于測(cè)試時(shí)間短，試驗(yàn)效率有所提高，同時(shí)避免了動(dòng)物試驗(yàn)成本高、周期長(zhǎng)、重復(fù)性差及人體安全等問題，所以現(xiàn)在各企業(yè)和研究人員會(huì)優(yōu)先考慮體外評(píng)價(jià)法。

1 安全性評(píng)價(jià)體外方法

1.1 3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)

作為動(dòng)物皮膚光毒性試驗(yàn)的一種體外替代方法，我國(guó)體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)的技術(shù)已通過國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試，試驗(yàn)技術(shù)日臻成熟，試驗(yàn)步驟容易操作，測(cè)試費(fèi)用低，測(cè)試周期短。

3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)結(jié)果是通過比較細(xì)胞毒性來判斷的，該試驗(yàn)中的細(xì)胞毒性表現(xiàn)為在試驗(yàn)樣品被模擬陽光輻射后的18～24小時(shí)，活性染料中性紅（NR）攝取的濃度來呈現(xiàn)的。NR是一種深綠色結(jié)晶性粉末、弱的陽離子染料，其在常溫常壓下穩(wěn)定，是一種活體及細(xì)胞的染色劑。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)的pH值接近中性時(shí)，NR不帶電，而是變成帶正電并困在低pH的溶酶體腔內(nèi)。低pH的溶酶體腔的維持，需要ATP，并且依賴于溶酶體膜的完整性。光毒素可通過形成活性氧（ROS）等機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致溶酶體膜通透性增加、pH梯度降低等逐漸形成的變化是不可逆的。這種情況引起的變化會(huì)導(dǎo)致NR的攝取和結(jié)合的減少，因此有可能區(qū)分活細(xì)胞和受損或死亡細(xì)胞。

秦美蓉等[1]通過對(duì)3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)的驗(yàn)證研究，驗(yàn)證了3T3成纖維細(xì)胞中性紅攝取試驗(yàn)檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)光毒性試驗(yàn)方法的可行性。

1.2 3D皮膚模型刺激性試驗(yàn)

3D皮膚模型是將特定細(xì)胞從人體活體皮膚組織中獲取并分離出來，后將細(xì)胞培養(yǎng)于特定的培養(yǎng)液上而得到的具有高度模擬人體皮膚模型。因?yàn)楦梭w有相似的保護(hù)系統(tǒng)，因此可以避免因種間差異造成的試驗(yàn)結(jié)果偏差。市場(chǎng)上常用的三維皮膚模型包括3D黑素皮膚模型（有我國(guó)的MelaKutis、美國(guó)的MelanoDerm等）、3D表皮模型（EpiKutis）、3D全層皮膚模型（有美國(guó)的EpiDrmFT、我國(guó)的FulKutis等）。皮膚刺激性試驗(yàn)適用的皮膚模型是體外重組表皮模型EpiKutis、EpiDerm等。

皮膚模型體外刺激性評(píng)價(jià)主要包括皮膚刺激性單點(diǎn)試驗(yàn)（SIT）和時(shí)間毒性（ET50）試驗(yàn)。SIT試驗(yàn)是將防曬化妝品或原料與表皮模型反應(yīng)，沖洗干凈，于特定條件的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，用MTT法對(duì)反應(yīng)后的表皮模型進(jìn)行細(xì)胞活性的測(cè)試。根據(jù)皮膚表面組織活力來定性評(píng)價(jià)防曬化妝品或原料有無刺激性，組織活力大于50%判為無刺激性（NI）;組織活力小于50%判為有刺激性（I）。對(duì)于部分溫和的防曬化妝品或原料，需要延長(zhǎng)樣品在模型的表面的停留時(shí)間，按照不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行暴露，以時(shí)間毒性（ET50）進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同防曬化妝品或不同原料之間的刺激性強(qiáng)弱。以不同時(shí)間點(diǎn)組織活力下降曲線來判定，ET50越小，表示模型對(duì)防曬化妝品或原料的耐受時(shí)間越短，則防曬化妝品或原料的時(shí)間毒性越強(qiáng)，因此時(shí)間毒性試驗(yàn)特別適用于原料或配方與時(shí)間相關(guān)的刺激性進(jìn)行比較。

Kandárová[2]等使用EpiDerm SIT驗(yàn)證皮膚模型在皮膚刺激性中的可行性，可以區(qū)分有無刺激性。簡(jiǎn)而言之，使用3D皮膚模型評(píng)價(jià)防曬化妝品或原料的皮膚刺激性，試驗(yàn)周期短，相對(duì)于動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)，因其操作簡(jiǎn)單、評(píng)價(jià)指標(biāo)直觀、測(cè)試成本減少、測(cè)試費(fèi)用減少等特點(diǎn)，日益受到研究人員和企業(yè)的青睞。

1.3 眼刺激試驗(yàn)

1.3.1 短時(shí)暴露試驗(yàn)

短時(shí)暴露試驗(yàn)采用的是兔角膜上皮細(xì)胞（SIRC），在培養(yǎng)板培養(yǎng)，然后將測(cè)試樣本暴露后，采用CCK-8細(xì)胞毒性測(cè)試法定量檢測(cè)細(xì)胞存活率。暴露后的細(xì)胞與CCK-8試劑反應(yīng)，活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶會(huì)將CCK-8試劑還原成橙黃色的甲臜染料，存活細(xì)胞越多，被還原成的染料就越多，這時(shí)候，不同的顏料顏色與存活的細(xì)胞數(shù)量有線性關(guān)系。測(cè)定波長(zhǎng)450 nm時(shí)的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞的生存率，最終判斷樣品的眼刺激性程度。細(xì)胞的存活率大于70%，可判定樣品為無刺激或具有輕微刺激性;細(xì)胞的存活率小于或等于70%，需進(jìn)行刺激性確認(rèn)試驗(yàn)，刺激性確認(rèn)試驗(yàn)后，如果細(xì)胞的存活率大于30%，證明樣品為中等眼刺激的樣品，如果細(xì)胞的存活率小于或等于30%，證明樣品為強(qiáng)眼刺激的樣品。

細(xì)胞培養(yǎng)是指將組織用胰蛋白酶等處理分離出來，于模仿人體體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境等條件下培養(yǎng)。其要在一定的生理?xiàng)l件下才能存活，對(duì)生存條件比較嚴(yán)苛。細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于我國(guó)的細(xì)胞學(xué)、化妝品等各個(gè)領(lǐng)域，成為基礎(chǔ)研究科學(xué)的重要組成部分。黃瓊[3]等研究基因轉(zhuǎn)染家兔角膜上皮細(xì)胞，通過破裂解法提取質(zhì)粒、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染結(jié)果的免疫組化檢測(cè)等試驗(yàn)步驟，證實(shí)了外源基因可以轉(zhuǎn)移至兔角膜上皮細(xì)胞內(nèi)，為提高外源基因的靶向性和轉(zhuǎn)移效率提供了研究方向。

1.3.2 體外重組人角膜上皮模型試驗(yàn)

體外重組人角膜上皮模型是由正常人角質(zhì)細(xì)胞的非角質(zhì)化上皮構(gòu)成，能夠模擬多層角膜上皮。據(jù)研究，SkinEthicTM和EpiOculaTM在眼刺激性試驗(yàn)中具有良好的重復(fù)性。該試驗(yàn)是將防曬化妝品或原料涂布作用于三維重組類似人角膜上皮組織模型，一定時(shí)間暴露后經(jīng)過清洗、孵育等步驟，通過MTT試驗(yàn)測(cè)試組織細(xì)胞生存率，從而判定樣品的刺激性。相對(duì)于陰性對(duì)照組織，樣品平均組織活性大于60%時(shí)，判定該防曬化妝品或原料無眼刺激性（NI）;樣品平均組織活性小于或等于50%，判定該防曬化妝品或原料具有眼刺激性（I）。

劉小勇[4]等成功探討了人羊角膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜上皮細(xì)胞的可塑性及其重建角膜上皮的可行性，利用角膜基質(zhì)作為載體誘導(dǎo)HAECs分化，得到了在形態(tài)結(jié)構(gòu)以及在角膜上皮特異性表面標(biāo)志蛋白CK3/12表達(dá)上，均類似角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞，進(jìn)一步證明角膜基質(zhì)微環(huán)境在調(diào)控角膜上皮細(xì)胞的分化過程中起重要作用。

2 結(jié)語

物理防曬劑是不吸收紫外線的，它只起到物理阻擋及反射、散射紫外線的作用，是不改變自身的一個(gè)成分，相對(duì)于化學(xué)防曬劑來說比較穩(wěn)定。而化學(xué)防曬劑會(huì)吸收紫外線能量，大多化學(xué)防曬劑是可被皮膚吸收，然后進(jìn)入皮下組織、血液循環(huán)系統(tǒng)等，而被皮膚吸收的成分是否存在潛在風(fēng)險(xiǎn)仍是未知數(shù)。由于目前企業(yè)或機(jī)構(gòu)對(duì)于多種化學(xué)防曬劑一起使用是否有相互作用的研究不多，在試驗(yàn)防曬產(chǎn)品的復(fù)配中，沒有控制多種化學(xué)防曬劑濃度的限度，種種因素疊加，可能給使用防曬化妝品的消費(fèi)者帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 秦美蓉.3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)的驗(yàn)證研究[J].今日藥學(xué)，2012，22（11）：687-689.

[2] Kandárová H，Hayden P，Klausner M，et al.An In Vitro Skin Irritation Test（SIT）using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal（RHE）Model[J].Electrophoresis，2009，（29）：1366.

[3] 黃瓊，胡燕華，姜發(fā)綱，等.脂質(zhì)體介導(dǎo)TGF-β1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染家兔角膜上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J].眼視光學(xué)雜志，2002，4（2）：103-105，108.

[4] 劉小勇，陳劍，周清，等.人羊角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)重建角膜上皮的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)病理生理雜志，2012，28（4）：689-693.