鐵觀音與荊芥提取物協(xié)同抗氧化作用研究

龐海月 黃立森 陳煜沛 吳黌坦 陳芳芳 王貴弘

摘要：為研究鐵觀音提取物和荊芥提取物聯(lián)用在抗氧化方面的協(xié)同作用，采用水浸提法分別萃取鐵觀音和荊芥得其抗氧化活性成分。以蘆丁為標準品檢測兩種提取物類黃酮含量，其中鐵觀音提取物為15.13 mg/g，荊芥提取物為0.87 mg/g;以沒食子酸為標準品檢測兩種提取物的總酚含量，其中鐵觀音水提物為50.87 μg/mg，荊芥水提物為47.40 μg/mg。用2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）和2，2'-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）法評估兩種提取物聯(lián)合應用時的抗氧化活性，結(jié)果表明，在較低濃度時，鐵觀音與荊芥提取物聯(lián)用具有協(xié)同增強抗氧化作用。

關(guān)鍵詞：協(xié)同作用;抗氧化;2，2-二苯基-1-苦基肼;2，2'-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）

Study on the Synergistic Antioxidant Effect of

Tieguanyin and Schizonepeta Extracts

PANG Haiyue1，2， HUANG Lisen1，2， CHEN Yupei1，2， WU Hongtan1，2， CHEN Fangfang1，2， WANG Guihong1，2*

1. Department of Public Health and Medical Technology， Xiamen Medical College， Xiamen 361023， China;

2. Engineering Research Center of Natural Cosmeceuticals College of Fujian Province， Xiamen 361023， China

Abstract：? In order to study the synergistic effect of Tieguanyin and Schizonepeta extracts on antioxidation， water?extraction method was used to extract the active components. The contents of flavonoids in the two water extracts?were determined by rutin method， and the contents of total phenols in the water extracts were 15.13 mg/g?（Tieguanyin） and 0.87 mg/g （Schizonepeta Tenuifolia） respectively. The contents of total phenols in the water extractswere determined by gallic acid assay， and the water extracts were 50.87 μg/mg （Tieguanyin） and 47.40 μg/mg?（Schizonepeta Tenuifolia）. The DPPH and ABTS methods were applied to assess the antioxidant activities of the two?extracts. The results show that the combined use of Tieguanyin and Schizonepeta Tenuifolia extracts had? syntheticallyenhanced the antioxidant effect.

Keywords： synergistic effect， antioxidant， DPPH， ABTS

飲茶是我國一種悠久的飲食文化，受到人民群眾的普遍喜愛[1]。茶之所以廣受歡迎，一是飲茶能使人身心振奮愉悅，二是受茶文化的熏陶，飲茶長期作為養(yǎng)生、休閑和交流的一種媒介[2]。現(xiàn)代科學研究也表明飲茶確實有益健康，這與茶葉中含有的茶多酚、咖啡堿、脂多糖、維生素、氨基酸等成分有關(guān)[3]，科學飲茶具有延緩衰老、抗輻射、預防腫瘤和心血管疾病、美容、抗菌、降脂、護齒等功效[4]。

許多文獻報道鐵觀音具有良好的抗氧化功能，這與其含有茶多酚、兒茶素、沒食子酸、黃酮等多種抗氧化物質(zhì)有關(guān)。荊芥是一種多年生唇形科草本植物，具有解表散風、透疹等功效，為臨床治療感冒、頭痛、麻疹、風疹、瘡瘍等疾病處方組成成分[5]，在民間也常用作泡茶和烹飪佐料，研究還表明荊芥具有一定的護胃功效。

為驗證荊芥與茶聯(lián)合應用能否在保證茶的作用功效的同時降低茶的濃度，減輕濃茶對胃黏膜的損傷，將茶和荊芥的水提取物聯(lián)合使用，以抗氧化功效為指標，研究合用荊芥對茶抗氧化活性的影響，結(jié)果表明兩者聯(lián)用在抗氧化方面具有明顯的協(xié)同增效作用，可以作為綠茶飲用方法的一種優(yōu)化方式。

一、材料與方法

1. 試驗材料與儀器

（1）試驗材料

一級濃香型鐵觀音（產(chǎn)于福建安溪），荊芥（購于廈門鷺燕大藥房，產(chǎn)自福建泉州安溪），ABTS總抗氧化檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），DPPH（2，2-二苯基-1-苦基肼）購于北京索萊寶科技有限公司;植物類黃酮含量檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，L-抗壞血酸、福林酚、沒食子酸購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

（2）主要儀器

MD酶標儀SPECTRAMAX I3X（Molecular Devices公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-300（瑞士BUCHI公司）、FreeZone冷凍干燥機（LABCONCO公司）、電子天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司）。

2. 方法

（1）鐵觀音與荊芥提取物萃取

取干燥的鐵觀音或荊芥碾磨，過40目篩，分別稱取100 g，用500 mL雙蒸水（dd H2O）浸提6 h（料液體積質(zhì)量比1∶10），浸提過程中，用超聲波處理儀（600 W，20 kHz）輔助。提取液經(jīng)過濾、旋蒸、冷凍干燥，得到干燥的茶提取物（T）和荊芥提取物（S），冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）鐵觀音與荊芥提取物總酚含量測定

標準曲線：準確稱取一定量的沒食子酸，用ddH2O配置成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的水溶液，再分別稀釋至0.500 00 、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL備用。

稱取鐵觀音和荊芥水提物，配置成10 mg/mL水溶液，5 000 r/min離心10 min，取上清液，備用。配置10%的Na2CO3水溶液，備用。

分別取500 μL的不同濃度沒食子酸標準溶液、鐵觀音水提物、荊芥水提物，放入各個試管中，加入500 μL福林酚試劑，混勻后室溫靜置5 min。再依次加入500 μL 10% Na2CO3溶液和350 μL ddH2O，混勻后避光反應1 h，之后測定在760 nm處的各吸光度，并計算總酚含量，其單位為μg/mg。

測得的標準曲線方程為：Y=31.31X+0.059 45（R2=0.994 2），式中X為沒食子酸質(zhì)量濃度（mg/mL），Y為吸光度。

（3）鐵觀音與荊芥提取物類黃酮含量測定

標準曲線：取10 mg/mL蘆丁標準液用標準品稀釋液稀釋至1.500 00、1.250 00、0.625 00、0.312 50、0.156 25、0.078 00、0.039 00、0.020 00 mg/mL備用。

待測樣品：分別取0.1 g鐵觀音水提物和荊芥水提物，加入1 mL 60%乙醇溶液，超聲功率400 W，60 ℃下提取30 min。室溫12 000 r/min離心10 min，取上清液，備用。空白對照用等體積的ddH2O替代。

參照植物類黃酮含量檢測試劑盒說明書，取200 μL待測樣品，各加入50 μL檢測試劑混勻后靜置5 min，再加入60%乙醇溶液300 μL后置于37 ℃水浴45 min，經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液，測定A470，計算?A=A測定-A對照，?A'=A標準-A空白。以蘆丁濃度為橫坐標，?A'為縱坐標繪制標準曲線為Y=0.614 4X-0.024 83（R2=0.9947），計算樣品中類黃酮的含量（mg/g）。

（4）鐵觀音與荊芥提取物抗氧化活性評估（DPPH法）

稱取一定量的DPPH粉末，用無水乙醇稀釋成 1.2 mmol/L DPPH工作液。96孔板的各檢測孔中分別加入100 μL各濃度鐵觀音水提物、荊芥提物、100 μL兩者混合物（鐵觀音和荊芥的混合物設置5個梯度，各梯度鐵觀音+荊芥的劑量分別為：0.100 mg/mL+0.100 mg/mL;0.050 mg/mL+0.025 mg/mL;0.025 mg/mL+0.050 mg/mL;0.020 mg/mL+0.050 mg/mL;0.050 mg/mL+0.020 mg/mL），再加入100 μL的DPPH溶液均勻混合，室溫避光反應10 min，測定517 nm波長處吸光度。

DPPH自由基清除率/%=100×（A空白組-A處理組）/A空白組，采用Compusyn軟件進行協(xié)同性分析。

（5）鐵觀音與荊芥提取物抗氧化活性評估（ABTS法）

按照ABTS總抗氧化能力檢測試劑盒說明配置ABTS工作液，96孔板的每個檢測孔中分別加入200 μL ABTS工作液，空白對照孔加入10 μL ddH2O;標準曲線孔內(nèi)加入10 μL各種濃度的Trolox標準溶液;樣品檢測孔中加入10 μL（0.100、0.050、0.025 、0.020 mg/mL）各濃度鐵觀音水提物、荊芥水提物或10 μL兩者混合物（鐵觀音和荊芥混合物仍設置上述5個梯度），均勻混合，室溫避光反應5 min，測定734 nm波長處吸光度。繪制Trolox標準曲線，并計算曲線方程，根據(jù)方程計算樣品組抗氧化能力（相對于Trolox的抗氧化活性），采用Compusyn軟件進行協(xié)同性分析[6]。陽性對照孔為L-抗壞血酸。

二、結(jié)果與分析

1. 鐵觀音與荊芥提取物類黃酮和總酚含量

在植物提取物中，抗氧化作用物質(zhì)主要為類黃酮和酚類物質(zhì)。根據(jù)標準曲線方程Y=0.614 4X-0.024 83（R2=0.9947），計算出鐵觀音提取物類黃酮含量為15.13 mg/g，荊芥提取物類黃酮含量為0.87 mg/g。根據(jù)標準曲線方程Y=31.31X+0.059 45（R2=0.9942），計算出鐵觀音提取物總酚含量為50.87 μg/mg，荊芥提取物總酚含量為47.40 μg/mg。兩種提取物酚類物質(zhì)含量較接近，而鐵觀音的類黃酮含量幾近荊芥提取物的2倍。

2. 聯(lián)合協(xié)同清除DPPH活性評估

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，其無水乙醇溶液呈紅紫色，能接受1個電子或氫離子，在波長為517 nm下具有最大吸收值。當有抗氧化物質(zhì)存在時，DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，褪色程度與抗氧化劑接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，抗氧化性活性越強吸光度越低，常用于評估抗氧化物質(zhì)的抗氧化強弱。

聯(lián)合作用指數(shù)（Combined index，CI）是判斷兩種藥物協(xié)同性的指標，0.9≤CI為疊加作用，0.8≤CI<0.9為低度協(xié)同，0.6≤CI<0.8為中度協(xié)同，0.4≤CI<0.6為高度協(xié)同，0.2≤CI<0.4為強協(xié)同作用[7-8]。鐵觀音和荊芥提取物聯(lián)合清除DPPH試驗結(jié)果（表1）表明，兩者的劑量為0.100 mg/mL+0.100 mg/mL和0.050 mg/mL+0.020 mg/mL的組合下清除DPPH活性的抗氧化能力較強，清除效率達到50%以上，但表現(xiàn)為中度協(xié)同（0.6≤CI<0.8）;其余3種組合下的CI值大于0.9，說明這3種組合下，鐵觀音與荊芥提取物聯(lián)合清除DPPH活性的能力表現(xiàn)為疊加，但清除效率降低，這可能與較低濃度下兩者提取物的抗氧化物質(zhì)含量差異有關(guān)。

3. 聯(lián)合協(xié)同抗氧化活性評估（ABTS法）

ABTS作為一種顯色劑，在適當氧化劑作用下，能夠氧化生成綠色的ABTS+，在存在抗氧化作用的物質(zhì)時，ABTS+會被抑制，顏色變淡，通過測定734 nm波長處的吸光度可以定量分析樣品的抗氧化作用強弱。

試驗結(jié)果（表2）與DPPH法相似，鐵觀音和荊芥的劑量為0.100 mg/mL+0.100 mg/mL、0.050 mg/mL+0.020 mg/mL、0.050 mg/mL+0.025 mg/mL的組合抑制ABTS+產(chǎn)生的CI值小于0.8，表現(xiàn)為中度協(xié)同;其余2種組合的CI值大于1，表現(xiàn)為疊加作用。

三、小結(jié)

飲茶是一種健康的生活方式，大部分茶口感清香甘甜，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如茶多酚、維生素、蛋白質(zhì)、碳水化合物和類脂等，深受世界各國人民喜愛。茶具有多種保健功能，抗氧化作用為其最典型的功效[6]，其功效強弱與茶的濃度呈正相關(guān)。然而，太濃的茶不僅口感大打折扣，而且對胃腸道具有一定的損害作用。

本研究將鐵觀音提取物和荊芥提取物聯(lián)合使用，分別以DPPH、ABTS為抗氧化評估指標，研究兩種提取物聯(lián)合使用對抗氧化功效的影響，結(jié)果表明，兩者的提取物在較低濃度表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，且當鐵觀音+荊芥劑量為0.025? mg/mL+

0.050 mg/mL和0.020 mg/mL + 0.050 mg/mL時還具有協(xié)同增強抗氧化作用。

如何在提高抗氧化效率的基礎(chǔ)上確定兩者的最佳協(xié)同組合尚待進一步研究，這也將為探索改善茶的口感和減輕濃茶對胃腸道的損害作用提供新的解決之道。

參考文獻

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