二氧化氯消毒劑在開放式組培中應(yīng)用試驗(yàn)初探

楊靜 張怡 何素芬 李雪 曹巧玲 王振

摘要：植物組織培養(yǎng)過程中，滅菌與消毒是防止微生物污染最基本的、最重要的環(huán)節(jié)，也是組培成功與否的關(guān)鍵因素之一。本試驗(yàn)以香石竹為培養(yǎng)材料，選用必潔仕牌二氧化氯消毒劑，對培養(yǎng)瓶、房間和外植體進(jìn)行消毒殺菌，再進(jìn)行接種培養(yǎng)，觀察其消毒殺菌效果，以及對外植體分化效果，為二氧化氯消毒劑應(yīng)用于植物組培快繁提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，供同行們參考。

關(guān)鍵詞：二氧化氯 消毒劑 香石竹 開放式組培

在植物組織培養(yǎng)過程中，防止和消除細(xì)菌、真菌及其他微生物的感染，除了培養(yǎng)基、培養(yǎng)瓶、接種工具用品必須嚴(yán)格消毒外，外植體表面消毒處理是非常重要的一環(huán)，也是外植體材料從帶菌狀態(tài)轉(zhuǎn)為無菌狀態(tài)的關(guān)鍵步驟。目前植物組培中最常用的消毒劑為氯化汞和次氯酸鈉等，汞為重金屬元素，對環(huán)境和人體都有極大的負(fù)面影響，同時(shí)國家嚴(yán)禁汞消毒廢液排入下水道，無害化處理操作繁瑣。次氯酸鈉殺菌效果常因植物種類不同，同一植物取材部位、取材時(shí)間不同而不同。我們以必潔仕牌二氧化氯消毒劑替代升汞和次氯酸鈉產(chǎn)品，在花卉香石竹組培過程中，用于外植體消毒試驗(yàn)探索，取得了一定的效果，但由于試驗(yàn)次數(shù)有限，試驗(yàn)結(jié)果僅供同行參考。

1.試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

香石竹莖段：選擇剪取當(dāng)年生長健壯無病蟲害感染的香石竹莖干，剪掉葉片，再剪成帶兩個(gè)葉節(jié)的莖段。

1.2藥劑與用品

必潔仕牌二氧化氯消毒劑、次氯酸鈉、酒精、洗衣粉、新潔爾滅、無菌水、剪刀、鑷子、不銹鋼盤、培養(yǎng)皿等。

2.試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)采取單因子試驗(yàn)，MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，6-BA、NAA用量不變，消毒劑處理方法和時(shí)間不變，只變動(dòng)消毒劑用量，分別為100㎎/L、80㎎/L、60㎎/L三個(gè)水平，用2%次氯酸鈉作對照，試驗(yàn)?zāi)康?，篩選不同用量必潔仕消毒劑對香石竹外植體殺菌效果以及對芽分化的影響。

3.操作方法與步驟

3.1房間消毒

按1片A劑加5mLB劑，熏蒸5立方米房間，如果房間污染較嚴(yán)重的，可使用3片A劑加15mLB劑，熏蒸5立方米房間。

3.2培養(yǎng)瓶浸泡消毒

取必潔仕消毒劑母液（1200㎎/L），按1：30比例將母液稀釋，倒入一個(gè)塑料盆中，將培養(yǎng)瓶和瓶蓋放入消毒藥液中浸泡5分鐘，用毛巾在消毒液中浸濕后，擦拭工作臺(tái)面，除塵消毒，再用75%酒精噴霧臺(tái)面，把培養(yǎng)瓶和瓶蓋從消毒液中撈起，瓶口、瓶蓋向下倒扣在工作臺(tái)桌面上。剪刀、鑷子等接種工具，經(jīng)高壓或干熱滅菌后取出直接放入75%酒精瓶中備用。

3.3培養(yǎng)基及配制

MS+6-BA2-3㎎/L+NAA0.1-0.2㎎/L+瓊脂7g/L+蔗糖28-30g/L

依次從配好的母液中量按需取出大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物營養(yǎng)液和6-BA、NAA于燒杯中，稱瓊脂、蔗糖，加水熬溶化后，倒入營養(yǎng)液混合煮沸定溶，調(diào)整pH值為5.8-6.0，加入抗菌劑，煮沸2-3分鐘，分裝培養(yǎng)瓶，待凝固后備用。

3.4外植體表面清洗與消毒

3.4.1外植體選擇

選擇生長健壯無病蟲害感染的當(dāng)年生香石竹莖段，剪去葉片，再剪成帶兩個(gè)葉節(jié)的小段。

3.4.2表面清洗與消毒

表面清洗與消毒，外植體取回來后，用自來水清洗表面，入三角瓶中加水和少許洗衣粉，振蕩洗滌1-2分鐘，自來水沖洗后，再加少許新潔爾滅振蕩洗滌后，在自來水下流水沖洗30-60分鐘，倒掉水后，加入75%酒精搖動(dòng)5-8秒，倒出酒精，用無菌水洗兩次，再把外植體材料放在60㎎/L-100㎎/L濃度必潔仕牌二氧化氯消毒劑溶液中振蕩消毒15分鐘。

3.5接種與培養(yǎng)

3.5.1接種方法

用浸泡培養(yǎng)瓶的消毒液擦拭工作臺(tái)，肥皂洗干凈雙手，再用75%酒精擦拭工作臺(tái)和雙手，打開瓶蓋，從75%酒精瓶中取出剪刀和鑷子，適當(dāng)剪去外植體莖段的兩端，用經(jīng)過滅菌的無菌紙吸去水多余的液滴，把外植體插入培養(yǎng)基中，蓋緊瓶蓋。

3.5.2室內(nèi)培養(yǎng)

有固定培養(yǎng)室的，把接種的培瓶擺放在培養(yǎng)架上，調(diào)控室內(nèi)溫度在25（±2）℃，光照2000-2500XL，也可利用自然光源在室內(nèi)培養(yǎng)。

4.試驗(yàn)觀察與統(tǒng)計(jì)

4.1污染統(tǒng)計(jì)

接種后3天起至12天結(jié)束觀察，三個(gè)不同濃度的二氧化氯消毒劑對外植體消毒效果，分別為60∠100∠80，最好的是80㎎/L，最差的是60㎎/L。污染和外植體死亡癥狀主要有三種情況：一是在外植體及其轉(zhuǎn)圍培養(yǎng)基上生長出白色或灰白色毛和黑色塊狀物;二是在培養(yǎng)基上形成紅色或白色菌斑，培養(yǎng)基變稀變臭;三是外植體葉或莖變白后死亡。其中濃度100污染較輕，變白致死的比例較重些，濃度為80、60的污染較重，變白致死較輕。對照試驗(yàn)的污染輕，但外植體變白死亡程度重。

4.2芽萌發(fā)與分化

外植體側(cè)芽萌發(fā)與叢生芽分化，接種第7天開始至20天觀察結(jié)束，二氧化氯消毒劑處理的外植體發(fā)芽早，接種7天開始萌芽，20天以后叢生芽數(shù)量顯著增多，叢生芽密集，弱苗細(xì)苗無效苗多，有玻璃化苗出現(xiàn)?？傮w表現(xiàn)：側(cè)芽萌發(fā)早（7天開始發(fā)芽）、多（平均1-12個(gè)），從生芽生長弱，葉片細(xì)長，葉色淡，有卷曲狀。對照材料發(fā)芽遲，接種15天后才有側(cè)芽萌發(fā)，叢生芽分化少，25天后叢生芽才分化，平均只有1-3個(gè)。

5.分析與討論

5.1在外植體及其轉(zhuǎn)圍培養(yǎng)基上生長出白色或灰白色毛和黑色塊狀物，多為真菌或其他老霉菌引起的污染?？赡茉?，接種環(huán)境和空氣帶菌，消毒不干凈;工作人員操作不熟練，不規(guī)范，敝開瓶口和材料暴露時(shí)間過久，被空氣中雜菌感染所致。

5.2在培養(yǎng)基上形成紅色或白色菌斑，培養(yǎng)基變稀變臭，多為細(xì)菌引起的污染?？赡茉?，工作臺(tái)、接種工具用具用品消毒不干凈，接種人員操作不規(guī)范，接種時(shí)工具與工作臺(tái)，瓶外壁觸碰，將菌源帶入所致;還有可能是材料自身體內(nèi)毒素向外溢出造成培養(yǎng)基污染。

5.3外植體變白后壞死，可能原因，消毒劑使用濃度過高，浸泡時(shí)間過長，外植體材料剪口破損，消毒液浸入材料內(nèi)部造成細(xì)胞組織受藥害導(dǎo)致中毒害死亡。

5.4外植體消毒不徹底，抗菌劑成分與配量沒達(dá)到最佳，材料體內(nèi)帶毒，表面消毒不能徹底消除體內(nèi)菌源，在培養(yǎng)過程中不斷產(chǎn)生出霉菌體并漫延所致。

5.5討論

必潔仕牌二氧化氯消毒劑，殺菌廣譜、能夠高效殺菌;無毒、無殘留、對人身體沒有傷害、對皮膚無刺激性;使用方法靈活多樣，即可以熏蒸對空間消毒，又可以配制成稀釋液，既可以對培養(yǎng)瓶浸泡殺菌，還可代替升汞作為外植體消毒，操作方便，省工省時(shí)，可大提高勞動(dòng)效率。

但由于植物生長環(huán)境和材料本身差異，以及取材時(shí)間、部位不同，各種植物表面攜帶菌類和內(nèi)生菌種類均不同，所以不同種類的外植體消毒方法、使用濃度、處理時(shí)間均有待進(jìn)一步探索試驗(yàn)。

作者簡介：

楊靜（1981-）女 碩士研究生 園林工程師 研究方向 園林工程與植物組織培養(yǎng)技術(shù)