基因組測(cè)序分析礦山作物長勢(shì)差異區(qū)域的土壤微生物群落多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群的篩選

劉芝言 林潼 臧穎 謝懿雯 王紅蕾

摘要：本研究為探究廢棄礦山不同環(huán)境的微生物群落分布和土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，分析植物長勢(shì)差異地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌群的區(qū)別，采用高通量測(cè)序技術(shù)研究河南省某廢棄礦山上植物長勢(shì)差異區(qū)域的微生物群落組成，并對(duì)土壤中優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行分離鑒定，進(jìn)而解析優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)土壤環(huán)境的影響。研究發(fā)現(xiàn)廢棄礦山土壤pH偏堿性，植物長勢(shì)優(yōu)異地區(qū)土壤中優(yōu)勢(shì)菌群為NEW-1、NEW-2，經(jīng)初步鑒定NEW-1菌株為Gemmatimonas，NEW-2菌株為Acidobacterium。結(jié)果表明，兩區(qū)域豐富度最高菌群為耐堿性菌株，而植物長勢(shì)優(yōu)異區(qū)域土壤含有的產(chǎn)酸菌群豐富度較高，推測(cè)酸桿菌的豐富度高導(dǎo)致土壤堿性降低，進(jìn)而為植物的生長提高良好的環(huán)境。同時(shí)也可推測(cè)通過定性補(bǔ)充微生物來促進(jìn)植物生長來實(shí)現(xiàn)對(duì)破損環(huán)境的修復(fù)極具應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：土壤DNA提取;宏基因組;群落分布;分離鑒定

引言

土壤是地球上最大的微生物儲(chǔ)存庫[1]，其與植物及微生物呈現(xiàn)相輔相成的關(guān)系[2]。微生物群落能夠促進(jìn)植物對(duì)土壤中養(yǎng)分的吸收與活化，推動(dòng)土壤中碳氮磷硫等元素循環(huán)[3]。而土壤理化性質(zhì)的變化為微生物群落在空間分布以及結(jié)構(gòu)改變提供驅(qū)動(dòng)力[4]。微生物對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的功能、穩(wěn)定性和可持續(xù)性至關(guān)重要。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是土壤生態(tài)系統(tǒng)的預(yù)警和敏感性指標(biāo)之一。它在調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分和生態(tài)系統(tǒng)過程中起著重要的作用，是維持植物生長的關(guān)鍵[2]。土壤微生物的空間分布與植物和生境具有明顯的相關(guān)性。它在很大程度上受到土壤環(huán)境條件[5]，特別是土壤理化因子的影響。相對(duì)應(yīng)，土壤肥力和健康取決于化學(xué)成分，也取決于棲息在土壤中的微生物的種類和數(shù)量。微生物多樣性不僅對(duì)土壤環(huán)境有助，同時(shí)也和人類的生活息息相關(guān)[6，7]。

然而，受限于實(shí)驗(yàn)室純化培養(yǎng)的單一性，人類對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)存在局限性[8]，對(duì)微生物群落沒有深入的認(rèn)識(shí)。近年來，研究者結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)開發(fā)出許多新方法及技術(shù)，如變性梯度凝膠電泳[9]（DGGM）、隨即擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)[10]（RAPD）、限制片段長度多態(tài)性[11]（RFLP）以及土壤宏基因組學(xué)技術(shù)[12]等技術(shù)。宏基因組于1998年，Handelsman[13]等人提出，是指提取對(duì)應(yīng)環(huán)境中的全部遺傳物質(zhì)，然后再將提取到的遺傳物質(zhì)進(jìn)行建庫，通過對(duì)基因組文庫分析和篩選可以獲得很低新的生物分子。新一代的測(cè)序技術(shù)[14]可以避開建庫的工作，使得宏基因組技術(shù)更加便捷。宏基因組學(xué)是將全部微生物看作一個(gè)整體，研究微生物與自然環(huán)境以及生物體之間的關(guān)系。它克服了傳統(tǒng)基于培養(yǎng)方法的缺陷，使得研究者對(duì)環(huán)境中微生物群落具有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

近年來，隨著國家提出生態(tài)文明建設(shè)，越來越多的政策被實(shí)施，意在推動(dòng)生態(tài)環(huán)境有效轉(zhuǎn)好。而我國礦產(chǎn)開發(fā)存在時(shí)間較長、強(qiáng)度大、數(shù)量較多等問題[15，16]，導(dǎo)致廢棄礦山依靠自然系統(tǒng)恢復(fù)其生態(tài)環(huán)境的方式變得不可行。因此需要有效的治理方法對(duì)廢棄礦山生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行恢復(fù)，而目前關(guān)于礦山環(huán)境中微生物群落組成、分布及功能的研究依然較少。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)以及宏基因組技術(shù)分析了河南省某礦山區(qū)不同類型樣本的微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)差異，結(jié)合土壤理化性質(zhì)的區(qū)別，進(jìn)而分析了菌群的分布和適應(yīng)性，并篩選出優(yōu)勢(shì)菌株，旨在更全面地發(fā)掘環(huán)境的微生物資源，同時(shí)為廢棄礦山的土壤治理和修復(fù)以及后續(xù)菌肥的制作提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 土壤樣品的采集

樣品采集區(qū)位于中國河南省輝縣市，地理坐標(biāo)北緯35?17'～35?50'，東經(jīng)113?20'～113?57'之間。此采樣區(qū)域?yàn)閺U棄的礦山區(qū)，根據(jù)礦山區(qū)植物的生長狀態(tài)選擇兩個(gè)采樣點(diǎn)，命名為A區(qū)和B區(qū)。A區(qū)為長勢(shì)旺盛的荊條區(qū)，B區(qū)為沒有植物生長狀態(tài)區(qū)域。每個(gè)區(qū)域均采用五點(diǎn)取樣法，并且分別選擇表層土壤（0-3 cm）、植物根際土壤（20-23 cm）及深層土壤（40-43 cm），分別命名為A1、A2、A3和B1、B2和B3。將土壤樣品使用無菌取樣袋進(jìn)行保存，儲(chǔ)存于實(shí)驗(yàn)室4 ℃和-80 ℃?zhèn)溆谩? ℃土壤進(jìn)行后期的菌株分離篩選，-80 ℃土壤進(jìn)行基因組DNA提取及分析。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

1.3土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤pH值采用電位法測(cè)量。有效磷的測(cè)定采用0.05mol.L-1 HCl和0.025mol.L-1（1/2 H2SO4）浸提鉬銻抗比色法。有效鉀測(cè)定采用乙酸銨浸提-焰光度法。水解性氮的測(cè)定采用堿解-擴(kuò)散法。

1.3土壤DNA的提取

使用CTAB的方法進(jìn)行基因組DNA的提取

稱土樣5.0 g，加入13.5 ml DNA提取液（100 mmoL/L Tris，100 mmol/L EDTA，100mmol/L Na3PO4，1.5 mol/L NaCI，l% CTAB，pH值8.0），振蕩5 min;加入1.5 mL 10%SDS后，65 ℃水浴2 h，期間每隔15 min上下顛倒晃動(dòng)幾次;6 000 r/min離心10 min，取上清液，用等體積酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）各抽提2次，12 000 r/min離心15 min;取上清，加入2倍體積無水乙醇，4 ℃放置2 h（或者加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置2 h或過夜），12000r/min離心15 min，棄上清;沉淀加入5 mL預(yù)冷的70%乙醇，12 000r/min離心20 min，收集DNA沉淀，風(fēng)干，用適量雙蒸水溶解。使用酶標(biāo)儀和1%的凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量，-20℃保存并進(jìn)行后續(xù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1.4基因組測(cè)序

采用生工生物工程（上海）股份有限公司Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行土壤基因組測(cè)序，分析土壤菌群中的V3-V4保守區(qū)，對(duì)土壤樣品的宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行橫向及縱向分析，并對(duì)物種豐度、菌群間差異性等進(jìn)行比較分析。

1.5培養(yǎng)基

1.5.1富集培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L NaCl，固體培養(yǎng)基加入1.5%-2%的瓊脂。

1.5.2篩選培養(yǎng)基

酸桿菌的篩選使用V55培養(yǎng)基[17]。

芽單胞菌的篩選使用培養(yǎng)基配方[18]：0.5 g/L葡萄糖，0.5 g/L胰蛋白胨，0.5 g/L谷氨酸鈉，0.5 g/L酵母提取物，0.1 g/L硫酸銨，0.1 g/L七水硫酸鎂，1 ml/L維生素溶液，固體培養(yǎng)基加入1.5%-2%瓊脂，使用NaOH調(diào)節(jié)pH。維生素溶液：1 g/L煙酸，1 g/L維生素B1，0.5 g/L生物素，0.5 g/L對(duì)氨基苯甲酸，10 mg/L維生素B12，0.5 g/L泛酸鈣，0.5 g/L維生素B6，0.5 g/L葉酸。

1.6菌株的分離篩選

根據(jù)基因組數(shù)據(jù)結(jié)果，對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行富集分離篩選及鑒定。取5g含有優(yōu)勢(shì)菌群的土壤，加入50 ml無菌水及適量的玻璃珠，30℃搖床振搖2-3 h，進(jìn)行土壤的破碎及菌株的分離。將破碎的土壤靜置15-30 min，取上清進(jìn)行梯度稀釋，然后取適量稀釋液至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)（每個(gè)樣品3個(gè)平行樣），待其具有濁度之后，將菌液進(jìn)行梯度稀釋，在篩選固體培養(yǎng)基中進(jìn)行將菌落挑至新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布，30℃培養(yǎng)，待其長出單菌落，進(jìn)行純化及后期鑒定。

1.7菌株的鑒定

使用引物對(duì)27F/1492R（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’，1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）以待鑒定的菌株基因組DNA為模板進(jìn)行16s rDNA PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序分析。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，DNA template 2 μL，10 mM Primer F 1 μL，10 mM Primer R 1 μL，dNTPs（A T G C）4.0 μL，DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃10 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30cycles;72 ℃ 10 min;4 ℃保溫。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

2結(jié)果與分析

2.1土壤樣品分析

在河南省廢棄礦山區(qū)進(jìn)行土壤樣品的采集，植物生長狀態(tài)及地區(qū)環(huán)境條件如圖1所示，從圖中可以看出，A區(qū)域長有大量的植物，已經(jīng)恢復(fù)了正常的植物生長，而B區(qū)域幾乎沒有什么植物，推測(cè)A區(qū)土壤狀態(tài)已經(jīng)得到恢復(fù)，而B區(qū)土壤還處于一種待恢復(fù)的狀態(tài)。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，首先對(duì)A區(qū)和B區(qū)六點(diǎn)土壤理化性質(zhì)（pH、有效鉀、有效磷和水解性氮）進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表1。

從表1中可以看出，土壤樣品的pH值無顯著差別，維持在8.1-8.3左右，為堿性土壤，這與礦山區(qū)域的特征相符，礦山中的一些巖石經(jīng)過長時(shí)間的風(fēng)化之后將會(huì)產(chǎn)生一些氫氧根離子或鹽累計(jì)在土壤表層中，致使土壤呈堿性，這也為后期菌株篩選pH值的設(shè)定提供了參考。測(cè)定的土壤樣品有效鉀、有效磷及水解性氮具有差異，主要表現(xiàn)為A區(qū)這三種參數(shù)明顯高于B區(qū)，在2倍左右。并且在B區(qū)有效磷參數(shù)中，表層土壤（B1）中的有效磷數(shù)值比根際土壤（B2）及深層土壤（B3）高3倍左右。我們結(jié)合A區(qū)土壤的有效磷值，推測(cè)B區(qū)處于一個(gè)恢復(fù)前期，對(duì)于植物生長具有促進(jìn)作用的有效磷及水解性氮等物質(zhì)將會(huì)從表層逐漸往下層進(jìn)行滲透，從而達(dá)到恢復(fù)其植物生長正常值的狀態(tài)。

2.2 基因組測(cè)序分析

2.2.1 Alpha多樣性分析

從土壤性質(zhì)可知，AB兩區(qū)域的土壤具有差異性，因此分別對(duì)AB兩區(qū)域的土壤進(jìn)行基因組的提取，并進(jìn)行測(cè)序分析，依據(jù)測(cè)序結(jié)果首先對(duì)土壤樣品進(jìn)行了Alpha多樣性分析，Chao指數(shù)越高，表明此群落的豐富度越高，如表2所示，A區(qū)域的Chao指數(shù)明顯高于B區(qū)域，說明A區(qū)域的群落豐富度高于B區(qū)域，這與之前所推測(cè)A區(qū)域土壤已經(jīng)恢復(fù)一部分，而B區(qū)域剛進(jìn)入恢復(fù)期相對(duì)應(yīng)。ACE值也可以用來估計(jì)群落的豐富度，A區(qū)域與B區(qū)域的ACE值相差不大，無顯著差異，但總體來看，A區(qū)域的ACE值略高于B區(qū)域，這與Chao值所表明的現(xiàn)象相一致。

Shannon和Simpson指數(shù)可以用來估算樣品中群落的多樣性，Shannon值越高，代表樣品中群落的多樣性越高，而Simpson則相反，從表中可以看出，A區(qū)域和B區(qū)域的Shannon和Simpson指數(shù)相差不大，無顯著性差異，說明A區(qū)域和B區(qū)域樣品中群落的多樣性無太大差異，幾乎相一致，我們可以推測(cè)AB兩區(qū)域中菌群的種類無顯著性差異，而菌群豐度具有較大差異。

2.2.2 菌群豐度差異性分析

由Alpha多樣性中Chao和ACE指數(shù)，我們得到樣本中群落的豐度具有差異，而多樣性差異不顯著，因此對(duì)AB兩區(qū)域之間的菌群豐度進(jìn)行了橫向差異性比較。結(jié)果如圖2所示，進(jìn)行匯總了差異性較明顯的25個(gè)屬級(jí)別的菌群。從圖中可以看出，在屬級(jí)別上，A1較B1豐富度較優(yōu)勢(shì)的菌群主要為酸桿菌（Acidobacteria）、芽單胞菌（Gemmatimonadetes）、擬桿菌（Bacteroidetes）、未分類菌群（unclassified）等，而B1中豐富度較優(yōu)勢(shì)的菌群主要為放線菌（Actinobacteria）。A2和B2相比較，A2中豐富度較優(yōu)勢(shì)的菌群主要為酸桿菌（Acidobacteria）、芽單胞菌（Gemmatimonadetes）、未分類菌群（Unclassified）等，B2中豐富度較優(yōu)勢(shì)的菌群主要為放線菌（Actinobacteria）、變形菌（Proteobacteria）、浮霉菌（Planctomycetes）等。深層土壤區(qū)域A3和B3相比，A3中酸桿菌（Acidobacteria）、擬桿菌（Bacteroidetes）、厚壁菌（Firmicutes）的豐富度占優(yōu)勢(shì)，而B3中浮霉菌（Planctomycetes）、疣微菌（Verrucomicrobia）、未分類菌群（Unclassified）的豐富度占優(yōu)勢(shì)?？偟膩碚f，A區(qū)域中，除去未分類菌群，相對(duì)于B區(qū)域來說酸桿菌、芽單胞菌和擬桿菌豐富度具有較大優(yōu)勢(shì)，可以依據(jù)此數(shù)據(jù)進(jìn)行A區(qū)域的菌株篩選，后期應(yīng)用于B區(qū)域的土壤恢復(fù)。由于取樣區(qū)域中土壤呈堿性，推測(cè)酸桿菌的存在可能是為了使土壤的pH維持恒定并逐漸恢復(fù)正常。

2.2.3 功能分析

為了分析兩區(qū)域菌群豐富差異的原因，依據(jù)測(cè)序結(jié)果，使用PICRUSt軟件對(duì)兩樣本進(jìn)行基因功能預(yù)測(cè)，對(duì)eggNOG和KEGG進(jìn)行了預(yù)測(cè)，兩者同源基因簇?cái)?shù)目之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。eggNOG功能注釋結(jié)果如圖3所示，共分為25個(gè)功能區(qū)，其中在碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生源，細(xì)胞壁/膜/包源生源、通用功能預(yù)測(cè)及防御機(jī)制功能分類豐度上A區(qū)域顯著高于B區(qū)域（P<0.05）;KEGG代謝通路功能注釋結(jié)果如圖*所示，在酶家族、多糖的生物合成級(jí)代謝、輔因子和維生素的代謝、復(fù)制和修復(fù)及翻譯的功能分類豐度上A區(qū)顯著高于B區(qū)（P<0.05），而在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、膜運(yùn)輸及生物降解和代謝的功能分類豐度上A區(qū)顯著低于B區(qū)（P<0.05）。綜合AB兩區(qū)域基因功能預(yù)測(cè)，這說明在A區(qū)域的土壤微生物群落部分參與生長代謝的功能基因豐度顯著高于B區(qū)域，從而與菌群豐度差異相對(duì)應(yīng)，說明A區(qū)域的菌群對(duì)土壤生態(tài)恢復(fù)具有促進(jìn)作用。

2.3 優(yōu)勢(shì)菌株的篩選與鑒定

采用富集培養(yǎng)基及分離篩選培養(yǎng)基對(duì)A區(qū)域較優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分離篩選，共篩選得到兩株菌，其系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖4所示，從圖4A中可以看出，菌株NEW-1為芽單胞菌屬，其在A區(qū)域的表層及根際土壤中相對(duì)于B區(qū)域具有優(yōu)勢(shì)，并且由土壤的物理性質(zhì)可以看出，土壤的恢復(fù)可能是一種自上而下的緩慢過程，因此推測(cè)芽單胞菌可能對(duì)A區(qū)域的土壤恢復(fù)具有促進(jìn)作用。從圖4B可以看出，菌株NEW-2為酸桿菌屬，它在A區(qū)域的表層、根際及深層土壤中相對(duì)于B區(qū)域均具有優(yōu)勢(shì)，考慮到AB兩區(qū)域的土壤pH值偏堿性，推測(cè)其可能與土壤pH的恢復(fù)具有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論與討論

土壤是一個(gè)重要的生態(tài)系統(tǒng)，其包含有豐富的微生物資源，當(dāng)土壤受到人為和自然的破壞時(shí)，其生態(tài)系統(tǒng)將會(huì)發(fā)生改變，主要變現(xiàn)為，1：土壤中的N、P、K等有機(jī)物質(zhì)的流逝，使其不適宜植物生長;2：微生物的豐度將會(huì)發(fā)生變化;3：土壤的性質(zhì)發(fā)生改變，如pH等。在礦山土壤中土壤性質(zhì)的變化主要是pH呈堿性狀態(tài)，隨著時(shí)間的積累，礦石的風(fēng)化會(huì)導(dǎo)致氫氧根及鹽離子在土壤中沉積，從而導(dǎo)致其pH的改變。本研究主要是針對(duì)遭受破壞的礦山土壤的兩區(qū)域，已經(jīng)逐漸恢復(fù)植物生長和待恢復(fù)的土壤兩部分進(jìn)行比較。在Alpha多樣性中，能夠看出，其菌群的豐度具有差異，但菌群的組成的差異不顯著，并且區(qū)域之間的上層、根際及深層土壤也具有差異，主要表現(xiàn)為其土壤恢復(fù)的過程為由上至下的一個(gè)緩慢的過程。在屬級(jí)別的菌群豐度上，主要集中在酸桿菌、芽單胞菌及擬桿菌的差異，結(jié)合酸桿菌的生物活性可以看出，其差異性主要與pH的改變具有關(guān)系，礦山土壤的pH主要為堿性，在酸桿菌的存在下，土壤的pH將會(huì)逐漸恢復(fù)正常，以此來適宜植物的生長，從而恢復(fù)生物多樣性，這也與AB兩區(qū)域的pH些許差異相對(duì)應(yīng)。結(jié)合芽單胞菌及擬桿菌的性質(zhì)，推測(cè)其可能與植物的新陳代謝具有關(guān)系。在對(duì)功能分析中，也可以看出，A區(qū)的功能豐度高于B區(qū)的主要是在促進(jìn)植物生長方向，而B區(qū)高于A區(qū)的在生物降解及修復(fù)方向，這也與AB兩區(qū)域的特征相對(duì)應(yīng)。但前期菌群分析及功能分析主要是為菌株篩選及土壤修復(fù)奠定基礎(chǔ)，在其基礎(chǔ)上，能夠使用相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基得到相對(duì)應(yīng)具有豐度優(yōu)勢(shì)的菌群，為后續(xù)菌肥的制作及土壤修復(fù)奠定了一定的基礎(chǔ)。

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作者簡介：

第一作者：劉芝言（1989年3月16日），男，漢族，籍貫：吉林省公主嶺市，單位：長春工業(yè)大學(xué) 職稱：助理工程師 研究方向：環(huán)境微生物學(xué)。

第二作者：林潼（2002.02），女，漢族 籍貫：吉林省長春市 學(xué)歷：大學(xué)本科在讀 單位：長春工業(yè)大學(xué) 吉林省長春市。

第三作者：臧穎（2001.08），女，漢族，籍貫：吉林省延邊朝鮮族自治州，學(xué)歷：大學(xué)本科在讀 單位：長春工業(yè)大學(xué)。

第四作者：謝懿雯（2000年10月），女，漢族，籍貫：湖南省婁底市，學(xué)歷：大學(xué)本科在讀 單位：長春工業(yè)大學(xué)。

通訊作者：王紅蕾，女，漢族，籍貫：吉林省長春市 學(xué)歷：博士，單位：長春工業(yè)大學(xué) 職稱：講師 研究方向：環(huán)境微生物學(xué)。