鴉膽子油乳與鉑類化療藥物的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)

易飛 劉蕾 李爭(zhēng)光 馬翠翠

摘要： 目的：在胃癌SGC-7901細(xì)胞株及肺癌A549細(xì)胞株中探索不同濃度的鉑類藥物與鴉膽子油乳聯(lián)用時(shí)的抗腫瘤效應(yīng)。方法：采用MTT法檢測(cè)不同濃度的鴉膽子油乳注射液、鉑類藥物單用以及鴉膽子油乳注射液與鉑類化療藥聯(lián)用對(duì)胃癌SGC-7901/肺癌A549細(xì)胞的體外抑制率。結(jié)果：在胃癌SGC-7901細(xì)胞株鴉膽子油乳明顯降低三個(gè)鉑類藥物（奧沙利鉑、順鉑、卡鉑）的IC50;鴉膽子油乳與順鉑/卡鉑小劑量合用時(shí)為協(xié)同效應(yīng);鴉膽子油乳與奧沙利鉑合用大部分均為輕微協(xié)同作用。在肺癌A549細(xì)胞株中，鴉膽子油乳明顯降低兩個(gè)個(gè)鉑類藥物（順鉑、卡鉑）的IC50;鴉膽子油乳與順鉑/卡鉑小劑量合用時(shí)為協(xié)同效應(yīng)。結(jié)論：鴉膽子油乳與鉑類藥物聯(lián)用有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。

關(guān)鍵詞： ?鴉膽子油乳注射液;鉑類化療藥物;胃癌;肺癌

Abstract ?Objective： To explore the anti-tumor effect of different concentrations of platinum drugs combined with Brucea javanica oil emulsion in gastric cancer SGC-7901 cell line and lung cancer A549 cell line. Methods： MTT method was used to detect the inhibition rate of different concentrations of Brucea javanica oil emulsion injection， platinum drugs alone and combination of Brucea javanica oil emulsion injection and platinum chemotherapy drugs on gastric cancer SGC-7901 / A549 cells in vitro. Results： In gastric cancer SGC-7901 cell line， Brucea javanica oil emulsion significantly reduced the IC50 of three platinum drugs （oxaliplatin， cisplatin， carboplatin）; the combination of Brucea javanica oil emulsion and cisplatin / carboplatin was synergistic effect; most of the combination of Brucea javanica oil emulsion and oxaliplatin was slight synergistic effect. In A549 cell line of lung cancer， Brucea javanica oil emulsion significantly reduced the IC50 of two platinum drugs （cisplatin and carboplatin）， while the combination of Brucea javanica oil emulsion and cisplatin / carboplatin showed synergistic effect. Conclusion：The combination of Brucea javanica oil emulsion and platinum drugs has synergistic antitumor effect.

【中圖分類號(hào)】R73 ? ? ? ? ? ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ? ? ? ? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2021）05-060-02

鴉膽子為苦木科植物Brucea javanwa（L.）Merr.的成熟果實(shí)，鴉膽子油乳是以鴉膽子石油醚提取物為原料，以精制大豆磷脂為乳化劑制成的水包油乳劑[1]。做為目前公認(rèn)有效的中藥抗癌藥物之一，藥理研究證明鴉膽子油能夠抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性，抑制癌細(xì)胞DNA的活性[2]，臨床上多用于肺癌、肺癌腦轉(zhuǎn)移和消化道惡性腫瘤的治療。該藥增強(qiáng)化療藥物療效的臨床觀察研究比較多，如一項(xiàng)鴉膽子油乳聯(lián)合含鉑類一線化療方案治療非小細(xì)胞肺癌的Meta分析表明，鴉膽子油乳能提高非小細(xì)胞肺癌患者的化療效果等[3];有研究報(bào)道鴉膽子油乳與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞的抑制作用顯著高于這兩種藥物的單獨(dú)應(yīng)用[4];一項(xiàng)研究表明胃癌患者術(shù)后在接受替吉奧、奧沙利鉑化療基礎(chǔ)上加用鴉膽子油乳注射液可顯著提高其中期療效[5]，均表明鴉膽子油可提高化療藥物的臨床療效;但鴉膽子油乳提高化療藥物療效的基礎(chǔ)研究較少，本課題在胃癌細(xì)胞株SGC-7901及肺癌細(xì)胞株A549中研究鴉膽子油乳與鉑類化療藥物的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物和試劑

鴉膽子油乳注射劑（沈陽(yáng)藥大藥業(yè)責(zé)任有限公司，批號(hào)0118062312）;注射用順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)180801）;注射用卡鉑（齊魯制藥有限公司，批號(hào)BB2J8019）;奧沙利鉑注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)200301AN ）。RPMI-1640 培養(yǎng)基（HyClone公司，批號(hào)AE24464298）、胰蛋白酶（HyClone公司，批號(hào)J150021）、新生牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)18040502）、CCK-8試劑盒（biosharp公司，批號(hào)68096017）。人胃癌細(xì)胞株SGC-7901（中科院典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)）;人肺癌細(xì)胞株A549（中科院典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)）

1.2 細(xì)胞系

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901及人肺癌細(xì)胞株A549予10%胎牛血清的培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT 法檢測(cè)鴉膽子油乳體外聯(lián)合給藥的作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液（ 每1mL 6×104 ～8×104 個(gè)細(xì)胞） 。細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100μL，常規(guī)培養(yǎng)24h后加入100μL以培養(yǎng)液稀釋的藥物。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照、鴉膽子油乳和其他聯(lián)用藥物（順鉑、卡鉑、奧沙利鉑不同濃度單藥及聯(lián)用實(shí)驗(yàn)組），每組設(shè)3個(gè)平行孔。鴉膽子油乳設(shè)5個(gè)濃度（1250ug/ml、625ug/ml、313ug/ml、156ug/ml、78ug/ml）[6-7]，三個(gè)鉑類均按梯度設(shè)置相應(yīng)的5個(gè)濃度：順鉑（25ug/ml、13ug/ml、6ug/ml、3ug/ml、2ug/ml）;卡鉑（13ug/ml、6ug/ml、3ug/ml、2ug/ml、1ug/ml）;奧沙利鉑（50ug/ml、25ug/ml、13ug/ml、6ug/ml、3ug/ml），加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48h，MTT法測(cè)細(xì)胞活力（波長(zhǎng)570nm 吸光度，A570），計(jì)算抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次以上，以重現(xiàn)性良好為準(zhǔn)[5]，聯(lián)合用藥數(shù)據(jù)采用calcuSyn 軟件處理，求出各抑制水平的聯(lián)合指數(shù)（ combination index，CI） ，CI<1 表示聯(lián)用藥物之間有協(xié)同作用，CI 值越小協(xié)同作用越大; CI=1 表示聯(lián)用藥物之間為相加或無(wú)關(guān)作用，CI>1表示聯(lián)用藥物之間無(wú)協(xié)同關(guān)系，CI 值越大拮抗作用的可能性越大。化療藥單用及與鴉膽子油乳合用的半數(shù)抑制濃度（IC50）之間的比較使用T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 在胃癌SGC-7901細(xì)胞株及肺癌A549細(xì)胞株中分別得出鉑類單用及與鴉膽子油乳合用后IC50的變化

2.1.1 胃癌SGC-7901細(xì)胞株中鴉膽子油乳明顯降低三個(gè)鉑類藥物的IC50

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在胃癌SGC-7901細(xì)胞株中，鴉膽子油乳分別與奧沙利鉑、卡鉑及順鉑單用及合用時(shí)隨著藥物濃度增加，其抗腫瘤效應(yīng)也增加。與單用相比，鴉膽子油乳與之合用可以明顯降低鉑類藥物的IC50，鴉膽子油乳降低奧沙利鉑的IC50從（9.6780.92）ug/ml至（3.790.06）ug/ml（P<0.05），降低順鉑的IC50從（8.50.4）ug/ml至（1.30.6）ug/ml（P<0.01），降低卡鉑的IC50從（7.640.3）ug/ml至（2.340.21）ug/ml（P<0.01）。

2.1.2 肺癌A549細(xì)胞株中鴉膽子油乳明顯降低兩個(gè)鉑類藥物的IC50

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肺癌A549細(xì)胞株中，鴉膽子油乳分別與卡鉑及順鉑單用及合用時(shí)隨著藥物濃度增加，其抗腫瘤效應(yīng)也增加。與單用相比，鴉膽子油乳與之合用可以明顯降低鉑類藥物的IC50，鴉膽子油乳降低降低順鉑的IC50從（3.00.53）ug/ml至（0.80.05）ug/ml（P<0.01），降低卡鉑的IC50從（11.11.6）ug/ml至（1.90.5）ug/ml（P<0.01）。

2.2 鴉膽子油乳與鉑類藥物合用時(shí)，合用效應(yīng)和合用指數(shù)的關(guān)系。

根據(jù)中效方程式計(jì)算出兩藥合用在不同效應(yīng)時(shí)的合用指數(shù)CI，進(jìn)而判斷兩藥在不同效應(yīng)各自所需藥物濃度之間相互作用是協(xié)同、相加還是拮抗。以效應(yīng)fa為橫坐標(biāo)，CI為縱坐標(biāo)作量效曲線。通過(guò)聯(lián)合指數(shù)（CI）值的數(shù)值大小可以定量判斷藥物間相互作用的強(qiáng)度以及性質(zhì)（CI>1為拮抗作用，CI=1為相加作用，0.7<CI<1為輕微協(xié)同作用，0.3<CI<0.7為協(xié)同作用，CI<0.3為強(qiáng)協(xié)同作用）[8]。

胃癌SGC-7901細(xì)胞株中，鴉膽子油乳與奧沙利鉑合用，F(xiàn)a于CI的關(guān)系顯示：Fa>89%時(shí)兩藥表現(xiàn)為拮抗作用（CI>1），F(xiàn)a=89%時(shí)（CI=I），兩藥表現(xiàn)為相加作用;Fa<89%時(shí)兩藥表現(xiàn)為協(xié)同作用（CI<I）。鴉膽子油乳與卡鉑聯(lián)合時(shí)，F(xiàn)a與CI的關(guān)系顯示：Fa>81%時(shí)兩藥表現(xiàn)為拮抗作用（CI>1），F(xiàn)a=81%時(shí)兩藥為相加作用（CI=1），F(xiàn)a<81%時(shí)為協(xié)同作用（CI<I）。鴉膽子油乳與順鉑聯(lián)合時(shí)，F(xiàn)a與CI的關(guān)系顯示，F(xiàn)a>73%時(shí)，兩藥表現(xiàn)為拮抗作用（CI>1），F(xiàn)a=73%時(shí)，兩藥為相加作用（CI=1），F(xiàn)a<73%時(shí)為協(xié)同作用（CI<1）。

肺癌A549細(xì)胞株中，鴉膽子油乳與順鉑聯(lián)合時(shí)，F(xiàn)a與CI的關(guān)系顯示，F(xiàn)a>82%時(shí)為拮抗作用（CI>1），F(xiàn)a=82%時(shí)，兩藥為相加作用（CI=1），F(xiàn)a<82%時(shí)為協(xié)同作用（CI<1）。鴉膽子油乳與卡鉑聯(lián)合時(shí)，F(xiàn)a與CI的關(guān)系顯示，F(xiàn)a>71%時(shí)，為拮抗作用（CI>1），F(xiàn)a=71%時(shí)，兩藥為相加作用（CI=1），F(xiàn)a<71%時(shí)為協(xié)同作用（CI<1）。

3 討論

鴉膽子油乳注射液說(shuō)明書(shū)適應(yīng)癥為肺癌、肺癌腦轉(zhuǎn)移及消化道腫瘤，本研究在肺癌A549細(xì)胞株及胃癌SGC-7901細(xì)胞株中研究該中藥抗癌藥與化療藥物的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)。鉑類為肺癌的一線化療藥物[9]，臨床常用的有順鉑及卡鉑;鉑類也為胃癌的一線化療藥物[10]，臨床常用的有順鉑、卡鉑及奧沙利鉑;本研究在肺癌A549細(xì)胞株中研究鴉膽子油乳分別與順鉑及卡鉑的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)，在胃癌SGC-7901細(xì)胞株中研究鴉膽子油乳分別與順鉑、卡鉑及奧沙利鉑的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)。

從兩藥合用的效應(yīng)與合用指數(shù)關(guān)系中可以看出，在SGC-7901細(xì)胞株中，鴉膽子油乳與順鉑/卡鉑聯(lián)合使用時(shí)，在fa<0.5左右的低抑制效應(yīng)時(shí)，甚至呈現(xiàn)強(qiáng)協(xié)同作用，其余狀態(tài)呈現(xiàn)輕微協(xié)同作用或者協(xié)同作用;鴉膽子油乳和奧沙利鉑聯(lián)用大部分呈現(xiàn)輕微協(xié)同作用。在A549細(xì)胞株中，鴉膽子油乳與順鉑在fa<0.7均呈現(xiàn)強(qiáng)協(xié)同作用;該藥與卡鉑在fa<0.7時(shí)呈現(xiàn)協(xié)同作用。

奧沙利鉑注射液說(shuō)明書(shū)中藥代動(dòng)力學(xué)部分說(shuō)明以130mg/m2的劑量連續(xù)滴注2小時(shí)，其血漿總鉑達(dá)峰值5.1±0.8ug/mL;一項(xiàng)腫瘤患者靜脈滴入卡鉑的藥代動(dòng)力學(xué)研究得出靜滴結(jié)束時(shí)的平均血藥濃度為54.79±11.81ug/mL[11];一項(xiàng)在非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究得出順鉑體內(nèi)血藥濃度峰值為0.94±0.25ug/mL[12];一項(xiàng)液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定鴉膽子油脂肪乳注射液在癌癥患者體內(nèi)的血藥濃度的研究得出鴉膽子油乳靜脈注射后體內(nèi)藥物峰濃度為95.20±29.10ug/mL[13]，該4個(gè)藥在體內(nèi)藥物的濃度均為本實(shí)驗(yàn)中的偏低劑量范圍，故在體內(nèi)鴉膽子油乳與三個(gè)鉑類聯(lián)用均為協(xié)同作用。

鴉膽子油是以鴉膽子為原料提取的脂肪油，其有效成分主要為不飽和脂肪酸類成分[14]。有研究表明不飽和脂肪酸能降低-SH 基含量，促使細(xì)胞膜變薄，增加了抗癌藥向癌細(xì)胞內(nèi)滲入的機(jī)會(huì)，增加了化療藥物的濃度，產(chǎn)生殺滅或抑制癌細(xì)胞的效果[15]，此可為鴉膽子油乳與鉑類有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)的解釋之一。

鴉膽子油乳為細(xì)胞周期非特異性抗癌藥物，對(duì) G0，G， S，G2，M 期癌細(xì)胞有殺傷和抑作用，能明顯抑制腫瘤DNA的合成[16]。有研究表明鴉膽子油乳在體外能有效抑制SGC-7901 細(xì)胞的增殖， 其主要通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于S期來(lái)抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖[17]。而鉑類也為細(xì)胞周期非特異性抗癌藥物，可以協(xié)同抑制細(xì)胞周期。

鴉膽子油乳可顯著抑制肺癌細(xì)胞A549增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，相關(guān)作用機(jī)制可能是其可有效抑制肺癌細(xì)胞A549中凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)[18]。一項(xiàng)去氫鴉膽子苦素B（鴉膽子油主要成分之一）和順鉑在凋亡相關(guān)癌細(xì)胞死亡中的相互作用的研究表明：當(dāng)用去氫鴉膽子苦素B加順鉑處理A549細(xì)胞時(shí)，觀察到對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的協(xié)同作用。 去氫鴉膽子苦素B結(jié)合順鉑暴露可增加線粒體膜電位的去極化作用，并從線粒體釋放細(xì)胞色素c進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。 聯(lián)合治療還增強(qiáng)了Bax的蛋白表達(dá)，降低了Bcl-xL和Bcl-2的蛋白水平，并增加了caspase-3，caspase-9 和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的裂解。這些結(jié)果表明去氫鴉膽子苦素B通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體的凋亡途徑使A549細(xì)胞對(duì)順鉑敏感。在A549細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Nrf2的高組成型表達(dá)，這增強(qiáng)了癌細(xì)胞對(duì)包括順鉑在內(nèi)的化學(xué)治療劑的抗性。去氫鴉膽子苦素B降低了Nrf2及其靶基因的蛋白質(zhì)水平，這可能有助于增加細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，從而導(dǎo)致線粒體凋亡[19]。該研究證明了鴉膽子油乳和順鉑對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用。

本實(shí)驗(yàn)得出鴉膽子油乳與鉑類在腫瘤患者的應(yīng)用有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，其與其他化療藥物的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)還需進(jìn)一步研究。。

參考文獻(xiàn)：

[1] 汪秋紅，李金才.鴉膽子油提取制劑及臨床應(yīng)用[J].黑龍江醫(yī)學(xué)，2002，26（ 10） ： 762.

[2] 湯濤，蒙凌，陳陵際.鴉膽子油乳具有多藥耐藥逆轉(zhuǎn)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2001，17（5）：534-539

[3] 王權(quán)，王滿才，何曦冉，等.鴉膽子油乳聯(lián)合含鉑類一線化療方案治療非小細(xì)胞肺癌的Met分析[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37（13）：2022-2029

[4] 趙楠，李玉花，吳效科，等.鴉膽子油乳及聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌 SKOV3裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志 ，2015 ，35（1）：57-62

[5] 鄒天旭.胃癌術(shù)后輔助化療聯(lián)合鴉膽子應(yīng)用效果分析[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)雜志，2017，4（69）：13627

[6]宋萍，章燕君，何萍.鴉膽子油乳注射液的臨床藥物利用研究[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2013，11（ 27）：268-270

課題：成都市醫(yī)學(xué)科研課題，課題編號(hào)：2020071，成都市醫(yī)學(xué)科研課題，課題編號(hào)：2018047